2019 Fiscal Year Research-status Report
薬剤耐性問題克服に向けて：タンパク質主鎖との水素結合を指標とする阻害剤評価系開拓
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19K15712
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
佐藤 浩平 静岡大学, 工学部, 助教 (30756705)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | タンパク質化学合成 / 薬剤耐性 / HIV-1プロテアーゼ / 難溶性ペプチド / 水溶性タグ / ペプチドヒドラジド / 化学選択的反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
複数の安定同位体標識アミノ酸を導入したHIV-1プロテアーゼプローブ創製を目指し、2019年度はHIV-1プロテアーゼの効率的化学合成法の開発に取り組んだ。当初計画した固相上でのライゲーション反応を利用した合成経路は、反応効率の低さから断念せざるを得なかった。しかし液相でのHIV-1プロテアーゼ合成は合成中間体の難溶解性が問題となることが報告されている。そこで、ペプチドの難溶解性に起因する課題を解決するために、ペプチドヒドラジドを鍵中間体とする新規水溶性タグ導入手法の開発に取り組んだ。その結果、ペプチドヒドラジドとホルミル基を有する水溶性タグとの還元的Nアルキル化反応が化学選択的に進行する反応条件を特定した。また、本反応の生成物であるNアルキルヒドラジドに対して水溶液中銅(II)イオンを作用させるのみで加水分解反応が進行し、対応するペプチドカルボン酸が得られることが明らかとなった。これら一連の反応は無保護のペプチド基質に対して選択的に進行し、顕著な副反応やエピメリ化も認められないことから、汎用性の高い水溶性タグ導入手法としての利用が期待できる。特に従来法と比較して、タグ構造導入のために事前に特殊アミノ酸ユニットを合成する必要がないこと、固相合成後に溶解性が低いことが明らかとなった場合でもオンデマンドでタグ化可能であること、タグ化部位のアミノ酸は原理的に制限を受けないこと、などが利点として挙げられる。現在、本反応を利用したHIV-1プロテアーゼ合成を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画の段階では、HIV-1プロテアーゼを4つのペプチド鎖に分割し、固相担体上でライゲーション法によるペプチド鎖縮合を実施することで迅速合成のためのプラットフォーム構築を目指していた。しかし、予備検討の結果、固相担体上でのライゲーション反応の効率が極めて低いことが明らかとなり、合成計画を変更することとした。
新たに立案した合成経路では、3つのペプチドフラグメント（Fr(1-27), Fr(28-70), Fr(71-99)）から合成することとした。Fr(71-99)は難溶性ペプチドであることが過去に報告されていたため、これを直接合成に利用することは困難と考え、まずは溶解性を改善する新規水溶性タグ導入法の開発に取り組んだ。
簡便かつ汎用性の高い手法を指向し、容易に合成可能なペプチドヒドラジドを鍵中間体とする水溶性タグ導入法を立案した。すなわち、ペプチドヒドラジドに対して、ホルミル基を有する水溶性分子を水溶性タグとして利用することで化学選択的なヒドラゾン形成反応を利用して固相合成後のペプチドに対しても位置選択的にタグ化可能と考えた。ヒドラゾン結合はライゲーション条件での安定性が不十分であったため、対応するN-アルキルヒドラジドに変換してから利用することにした。この構造はライゲーション反応条件下安定であることが明らかとなり、また水溶液中銅(II)イオンを作用させるとアルキルヒドラジドの加水分解反応が進行し、対応するペプチドカルボン酸が高収率で得られることが明らかとなった。これら一連の反応は、アルデヒド修飾したLysオリゴマーを水溶性タグとして利用しても効率的に進行した。
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| Strategy for Future Research Activity |
複数の安定同位体標識アミノ酸を導入したHIV-1プロテアーゼプローブ創製に向け、まずHIV-1プロテアーゼの合成ルート確立を目指す。2019年度に見出した水溶性タグ導入法をプロテアーゼ合成に投入した予備検討では、所望のプロテアーゼが得られることが明らかとなっている。そこで、タグ導入反応、各ライゲーション反応、脱硫反応、銅イオンによるヒドラジド加水分解反応の条件最適化を進め、再現良く高効率で合成可能な堅牢な合成ルートへと昇華させる。また、HIV-プロテアーゼの合成が順調に進んだ場合は、同位体標識アミノ酸を導入したプロテアーゼ合成へと展開し、タンパク質主鎖と阻害剤間の水素結合検出システムの構築に挑戦する。
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| Causes of Carryover |
本研究課題を推進するうえで、中間体ペプチドの合成に最も時間と労力を要する。これを解決するために令和2年度に自動ペプチド合成装置の購入を計画しているため、次年度使用分を残した。次年度使用額を次年度予算と合わせて、自動ペプチド合成装置の購入に充てる。
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