2020 Fiscal Year Research-status Report
Cellular RNA imaging with membrane-permeable probe
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19K15713
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| Research Institution | Gakushuin University |
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Principal Investigator |
友池 史明 学習院大学, 理学部, 助教 (70708586)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 核酸プローブ / 遺伝子検出 / 核酸輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
目的遺伝子の発現を検出する核酸プローブを細胞内に輸送するため、タンパク質による輸送法の確立を試みた。具体的にはDNA結合能を持つバクテリア由来のヒストン様タンパク質とアーキア由来のヒストン様タンパク質に、膜透過ペプチドを導入することで膜透過能を付与する。
2019年度に、システインとマレイミドの不可逆的な共有結合形成を利用してループ部に膜透過ペプチドを導入したバクテリア由来のヒストン様タンパク質を調製したので、2020年度は、N末およびC末にCPPペプチドを導入したヒストン様タンパク質を調製し、ループに導入したものと比較した。その結果、ループ部に導入したものが核酸の輸送効率が高いことを示唆する結果を得た。また、導入時間を観察したところ、3時間程度で細胞内に核酸が導入されることを示唆する結果を得た。
2020年度は、バクテリア由来のヒストン様タンパク質だけでなく、アーキア由来のヒストン様タンパク質についても調製を試みた。発現プラスミドの構築は完了したが、不溶性画分に観察されており、未だ精製は成功していない。
2021年度は、バクテリア由来のヒストン様タンパク質に膜透過ペプチドを導入したものについて、これまでの知見を利用して大量発現・調製し、細胞内へ導入可能な核酸の特徴を調べ、プローブ輸送に必要な知見を収集する。また、アーキア由来のヒストン様タンパク質についても大腸菌内の発現条件や精製条件を再検討し、調製する。調製ができ次第、バクテリア由来ヒストン様タンパク質と同様に核酸の輸送条件を最適化する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度は、バクテリア由来ヒストン様タンパク質については、計画通り、膜透過ペプチドの導入位置を検討した。N末端、C末端に膜透過ペプチドを導入したバクテリア由来のヒストン様タンパク質を調製し、昨年度設計した内部に膜透過ペプチドが導入されたものと、細胞内への核酸輸送能を比較した。その結果、内部に膜透過ペプチドを導入したものが、他よりも細胞内への核酸輸送能が高いことが示唆された。また、核酸輸送の条件を検討するため、細胞内への輸送に要する時間を観察した。その結果、細胞内への輸送には3時間以上必要であることがわかった。このタンパク質の調製についても、精製条件を改善し、前年度よりも収率を向上することに成功している。よって、2021年度には、より多くの条件で検討が可能になる。このようにバクテリア由来のヒストン様タンパク質については、計画通りに研究が進んでいる。
2020年度には、アーキア由来のヒストン様タンパク質を利用した核酸輸送も計画していた。アーキア由来のヒストン様タンパク質については、二種類のタンパク質を検討している。その両方について、発現プラスミドが取得でき、また、膜透過ペプチドを末端に持つものの発現プラスミド構築も完了した。これにより、膜透過ペプチドの影響評価に必要な遺伝子がそろったといえる。しかし、大腸菌での発現と精製を試みたところ、発現量が少ない、または不溶性画分になる、という結果となり、未だ精製ができていない。よって、二種のアーキア由来ヒストン様タンパク質については、発現条件および精製条件を今後、検討していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は、核酸プローブの細胞内への輸送を実現するため、バクテリア由来のヒストン様タンパク質については、輸送できる核酸の構造について検討を、アーキア由来のヒストン様タンパク質については、発現・精製条件の最適化を行う。
2020年度までの検討で、バクテリア由来のヒストン様タンパク質による核酸輸送が可能であることを示唆する結果が得られている。しかし、バクテリア由来のヒストン様タンパク質は、ニックやミスマッチを含む二本鎖DNAとより強く結合する特徴を持っている。そこで、輸送に適した核酸の構造、すなわち、ミスマッチの位置や核酸の種類について検討する。また、2020年度の検討で発現・精製条件が改善されたため、大規模な発現・精製を行う。そして、これまでの輸送能観察は蛍光顕微鏡による観察であったが、フローサイトメーターを利用した定量的な観察も実施する。
アーキア由来のヒストン様タンパク質については、今のところ精製に成功していない。そこで、2021年度はアーキア由来のヒストン様タンパク質について、大腸菌での発現条件検討および精製の条件、具体的には破砕に用いる緩衝液の条件や尿素による可溶化を試みる。これらの検討によって、アーキア由来のヒストン様タンパク質の精製が完了次第、膜透過ペプチドを導入し、核酸との結合能が保持されていることの確認と、細胞内への核酸輸送を検討する。また、バクテリア由来のヒストン様タンパク質と同様に、輸送に適した核酸の構造についても検証する。
以上の検討を行った上で、核酸検出のプローブをヒストン様タンパク質によって細胞内に輸送し、細胞内の遺伝子発現が検出可能かを検討する。
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| Causes of Carryover |
アーキア由来のヒストン様タンパク質について、精製ができなかったため、核酸との結合能や細胞内への輸送能の検証ができなかった。そのため、次年度使用額が生じた。2021年度は、アーキア由来のヒストン様タンパク質について、発現・精製の条件を再検討し、精製ができ次第、精製タンパク質に膜透過ペプチドを導入し、核酸との結合能および細胞内への核酸輸送能の検証を行う。その過程で次年度使用額分を使用する予定である。
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