2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K15722
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
横正 健剛 岡山大学, 資源植物科学研究所, 助教 (50790622)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アルミニウム / イネ / 転写因子 / タンパク質相互作用 / シグナル認識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イネのアルミニウム耐性に関与する転写因子ART1のタンパク質レベルでの制御機構を明らかにするために、酵母のツーハイブリットスクリーニングを行った。ART1と相互作用するタンパク質を酵母のツーハイブリットを用いてスクリーニングし、11個の候補が得られた。そのうち5つのタンパク質はBBPI（Bowman-Birk Protease Inhibitor）に属していた。OsBBPIsの発現解析解析を行った結果、OsBBPI3.1、3.2と3.3が主に根で発現していた。さらに、Alに応答しOsBBPI3.2の発現量は12倍、OsBBPI3.1、3.3は4倍に増加した。しかし、これらの遺伝子はART1による制御は受けていなかった。生理学的な機能解析を行うために３重変異体を作出し、Al処理を行った結果、３重変異体は野生株に比べ根の相対伸長が阻害され、いくつかのART1制御下の遺伝子の発現量が野生株より低下していた。これらの結果からOsBBPIsの機能はART1の活性化ではないが、ART1機能の維持に関与していると予想している。
また、イネのアルミニウム感知に関わる分子機構を明らかにするために変異体のスクリーニングを行った。アルミニウムによって発現が誘導されるSTAR1のプロモーターにGFP遺伝子を導入した形質転換体（pSTAR1-STAR1GFP）にEMS変異処理を行い、アルミニウムを処理してもGFPの発現が増加しない変異体のスクリーニングを行った。これまでに約1200粒の種子を変異処理し、1000ライン以上のM2世代を用いたスクリーニングを行った。その結果、GFPの発現とART1の下流の遺伝子の発現が低下している変異体候補が複数ライン見つかった。これらの変異体候補の後代をもちいて表現型の確認とアルミニウム耐性の比較を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度の実績報告書に記載したようにこれまでにART1と相互作用するタンパク質の解析を行ってきた。しかし、これまでの3重変異体の表現からして、この遺伝子がイネのアルミニウムシグナルの直接の感知機構に関与しているとは考えにくい。今後は研究計画に記載したような新しい遺伝子（OsRAE1、OsRAE2）にも着目し、さらにこれらの遺伝子の関係性を明らかにして新しい知見を展開していきたい。アルミニウム感知に関する新規変異体のスクリーニングについては目標であったスクリーニングのライン数は達成した。さらに、変異体の中に既知のアルミニウム耐性に関わる転写因子であるART1の変異体が存在したことはスクリーニング方法のポジティブコントロールとなると考えられる。一方で現在候補遺伝子の特定には至っていない。その原因についてはスクリーニングで得られる変異体の中には生育が著しく悪いものや不稔となる変異体が少なくない。今後はまず、次世代の種子が十分にとれ、アルミニウムに対する表現型みられるものを解析していく。M1世帯などで植物体が維持できているものについてはもう一度GFPによるスクリーニングを行い、有望な株があればヘテロの材料を使って遺伝子の特定を試みる
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| Strategy for Future Research Activity |
1.アルミニウム非感知性変異体のスクリーニング
アルミニウム感知に関する変異体のスクリーニングを行う。アルミニウムによって発現が誘導されるSTAR1のプロモーターにGFP遺伝子を導入した形質転換体にEMS変異処理を行いGFPの発現が増加しない変異体のスクリーニングを行う。これまでのスクリーニングでいくつかの変異体候補を得ている。今年度はこれらの後代を用いて、Al耐性の比較やART1の下流の遺伝子発現についてリアルタイムPCRで確認する。また、親株やカサラスと掛け合わせた材料を準備し原因遺伝子の特定を試みる。
2.ART1と相互作用するタンパク質の機能解析
OsBBPI3.1、3.2、3.3はイネのアルミニウム耐性に関与する転写因子ART1とタンパク質レベルで相互作用する。これまでの研究からOsBBPI3の３重変異体はアルミニウム感受性となり、一部のART1制御下の遺伝子の発現に低下がみられた。現在、このOsBBPI3の機能はART1タンパク質の分解阻害ではないかと予想して研究を進めている。一方最近の研究からシロイヌナズナのF-boxタイプのE3 ligase、RAE1が転写因子STOP1の分解に関わることが報告された（Zhang et al., 2018）。イネではシロイヌナズナのRAE1と相同性の高い遺伝子が２つ（OsRAE1、OsRAE2）が存在する。今年度はイネのART1、OsRAE1,２とOsBBPI3.1、3.2、3.3のタンパク質相互作用についてPulldownアッセイをもちいて明らかにする。また、プロトプラストの一過的発現を用いた実験や変異体を利用しOsRAE1,2がART1のタンパク質分解に関わるのか、さらにOsBBPI3.1, 3.2, 3.3がそのART1タンパク質の分解を阻害するのかを明らかにする。
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