糸状菌転写因子ClrBとMcmAの協調によるセルラーゼ遺伝子発現誘導の分子機構

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K15731
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 國武 絵美 三重大学, 生物資源学研究科, 助教 (30800586)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Aspergillus nidulans / 遺伝子発現制御 / セルラーゼ / 転写因子間相互作用

Outline of Annual Research Achievements

モデル糸状菌Aspergillus nidulansのセルラーゼ遺伝子誘導機構の解明を目指して，セルラーゼ特異的転写活性化因子ClrBの活性制御機構の解析を進めた。蛍光タンパク質を融合したClrBを作製し，セルラーゼ誘導条件，抑制条件での細胞内動態を解析した。蛍光タンパク質融合ClrBの発現にはチアミンによって発現の制御が可能なthiApとclrBプロモーター(clrBp)を使用した。これらの株のセルラーゼ生産性をプレートアッセイにより解析したところ，clrBp使用株ではセルラーゼ生産が認められなかった。thiAp使用株ではチアミン非存在下ではセルラーゼを生産し，チアミン存在下で抑制されたことからthiApによる発現制御が想定通りに稼働することが確認できた。蛍光タンパク質の融合によりClrBのセルラーゼ遺伝子発現誘導能が低下していると考えられたものの，活性を有したタグ融合ClrBを取得することができたため，thiApを使用した菌株を後の解析に用いた。
炭素源に依存的なClrBの動態を蛍光顕微鏡観察とウェスタンブロット法により解析した。顕微鏡観察において，ClrBはセルラーゼ遺伝子の誘導物質であるセロビオース存在下で核に局在するが，時間の経過により核における蛍光強度は減少することが分かった。一方グルコースを炭素源とした培地や炭素源を含まない培地では細胞質での蛍光が見られた。ウェスタン解析ではセロビオースを含む培地を使用した場合でのみClrBを示すバンドのシグナル強度の減少が観察された。この結果はClrBが誘導物質依存的に核移行するとともに不安定化することを示唆する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

セルラーゼ特異的転写活性化因子ClrBの誘導物質依存的な細胞内動態を観察することを目的として蛍光タンパク質融合体の作製を試みた。発現プロモーターやリンカーの有無，融合する位置を検討した結果，セルラーゼ遺伝子発現誘導能を有する融合体を作製することが出来た。誘導物質依存的な細胞内動態を観察できたこと，また今後作製した株を使用した解析や同様の設計による機能ドメイン解析を進めていくことが可能であることから概ね順調であると評価した。

Strategy for Future Research Activity

炭素源に依存したClrBの翻訳後調節の有無，ClrBの機能ドメイン，McmAとの細胞内での相互作用に関して解析する。

Causes of Carryover

活性のあるタグ融合ClrBの作製に時間を要し，当初の予定よりも少し遅れたためClrBの翻訳後修飾等の解析を行うことが出来なかった。この解析については次年度に行う計画である。成果報告の出張費も未使用分が出たため，次年度に充てる。