2019 Fiscal Year Research-status Report
コリネ型細菌の物質生産宿主としての汎用性拡大に向けた代謝工学と合成生物学的利用
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19K15736
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
片岡 尚也 山口大学, 大学院創成科学研究科, 助教 (50713509)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | コリネ型細菌 / α-ケトグルタル酸 / 2-ヒドロキシグルタル酸 / フェニルアラニン / シキミ酸経路 / フェニルプロパノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は, 当初の予定とは少し異なるが, α-ケトグルタル酸およびその誘導体を著量蓄積しうる培養条件の検討と組替えコリネ型細菌の造成を実施した。具体的には, まず, グルコース完全合成培地中の窒素量およびビオチン量の検討をジャーファメンターを用いた回分培養により行った。その結果, 野生株を低窒素かつビオチン量を制限した条件で培養した際に, 著量のα-ケトグルタル酸を培地中に生成することを確認した。次いで, α-ケトグルタル酸の炭素流量を高めるべく, 乳酸脱水素酵素 (ldhA), リンゴ酸脱水素酵素 (mdh), イソクエン酸リアーゼ (aceA) を欠損するとともに, 強力なプロモーター (tuf遺伝子プロモーター) 支配下に2-ヒドロキシグルタル酸脱水素酵素をコードしているAcidaminococcus fermentans由来hgdH遺伝子を配置したカセットをゲノム中 (Cgl1734-Cgl1735間) に挿入した組替え株を作製し, 決定した培養条件で培養したところ, 2-ヒドロキシグルタル酸の生成に成功した。また, 上記の研究と並行して, コリネ型細菌を用いるフェニルプロパノイド生産に向けたフェニルアラニン高生産コリネ型細菌の構築に取り組んだ。具体的には, フェニルアラニンへの炭素流量を高めるための枝分かれ代謝の欠損 (hdpA, qsuB, qsuD, ppc) およびシキミ酸経路の強化 (aroE, aroCKBのゲノム加工での高発現) を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では, アセチルCoA, α-ケトグルタル酸を蓄積するコリネ型細菌の造成とその有用物質生産への応用を目的としている。当初, 本年度は, アセチルCoAの蓄積に関して研究を進める予定であったが, 研究の過程でα-ケトグルタル酸を著量蓄積する培養条件に遭遇したため, 予定を変更して研究を進めた。その中で, 前述の培養条件の発見に加え代謝工学および合成生物学的アプローチにより, 2-ヒドロキシグルタル酸の生成に成功したことから, 標的分子は異なる (アセチルCoAではなくα-ケトグルタル酸) ものの予定した高蓄積条件の設定および応用利用を実証できているため, 上記のように評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度生産に成功したα-ケトグルタル酸誘導体である2-ヒドロキシグルタル酸以外のα-ケトグルタル酸誘導体 (特に, 予定している1,4-ブタンジオール) の生産に取り組むとともに, アセチルCoAを高蓄積する組替えコリネ型細菌の造成に取り組む。おおむね順調に進展していることから, 研究計画の変更, 研究を遂行する上での課題は現時点ではない。
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| Causes of Carryover |
充足率が低かったため, 予定していた卓上型培養装置MDL-200の購入を見送ったことが原因の大きな部分を占めている。有効活用の方法として, 市販されていない, 生産を試みる予定であるα-ケトグルタル酸誘導体の外注による合成費用が挙げられる。
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