2020 Fiscal Year Research-status Report

独立栄養性細菌の新規アミノ酸生合成経路探索を通じた炭酸固定代謝の理解

Research Project

Project/Area Number	19K15745
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	千葉洋子国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (70638981)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	アミノ酸生合成 / 新規酵素 / 炭酸固定経路 / 代謝進化
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、深海熱水孔から発見され、進化的に古い特徴を残していることが期待される好熱性独立栄養性細菌のグリシンおよびセリンの生合成経路を明らかにすることである。そして様々な微生物における炭酸固定経路およびアミノ酸生合成経路の多様性を包括的に理解することで、初期生命の姿および進化について新たな知見を得ることを目指す。本年度は昨年度その存在が強く示唆された新規セリン生合成酵素を同定することを試みた。具体的には、本酵素の有する特殊な補酵素依存性および近縁種との比較ゲノム情報を基に、本菌の有する機能未知遺伝子の中から新規セリン生合成酵素の候補遺伝子を絞り込んだ。これら候補遺伝子を大腸菌にて異種発現させ、部分的に精製したのちに、目的活性の有無を確認した。この結果、発現・精製した10程度の候補遺伝子全てが期待されたセリン生合成活性を有さないことが明らかとなった。すなわち、新規セリン生合成酵素は未同定である。加えて、研究対象の好熱性独立栄養性細菌と比較的近縁の好熱性従属栄養性細菌のアミノ酸生合成経路を、安定同位体プロービング法を用いて明らかにした。これはもし両者に共通の経路が示唆されれば、上述の新規酵素の探索が容易になるからである。しかし、本好熱性従属栄養性細菌は研究対象の好熱性独立栄養性細菌とは異なる代謝経路でグリシンおよびセリンを得ていることが明らかとなり、期待された共通点は見つからなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 感染症拡大の影響により職場の出勤制限および保育園の休園があり、想定していた量・質の研究活動を行うことが不可能であった。また、新規酵素同定のためにゲノム解析による候補遺伝子の絞り込みを行ったが、候補遺伝子全てが期待した機能を有さず新規酵素の同定ができなかった。
Strategy for Future Research Activity	新規酵素の同定について、研究対象の好熱性独立栄養性細菌は増殖が弱く、菌体から活性を指標にタンパク質を精製し、新規セリン生合成酵素を同定することが困難であると考え、これまでリバースジェネティクスの手法を用いて同定を試みてきた。しかしリバースジェティクスの手法で同定できなかったため、非常に労力がかかるが正攻法であるフォアードジェネティクスの手法を用いる。現在酵素精製に必要な大量の菌体を得るために、本細菌の大規模培養方法を確立しているところである。大量培養が達成されたら、菌体から活性を指標に新規タンパク質を精製・同定する。同定に成功したら、以下のことを行う。新規セリン生合成酵素の生物間分布：　同定された酵素遺伝子のホモログがどのような生物に存在するかin silicoレベルで明らかにする。必要があればそれらホモログが本当に新規セリン生合成酵素であるかを大腸菌発現・酵素活性測定により生化学的にも確認する。セリン生合成酵素と炭酸固定経路のタイプに相関関係があるかの検討：　様々な独立栄養性微生物の炭酸固定経路の種類とグリシン・セリン生合成経路の種類をリストアップし、そこに関係性があるかどうかを検討する。特にphosphorylated セリン生合成経路に関与する酵素はその遺伝的バックグラウンドによって既知のものはタイプ１、２、３に分類され、今回タイプ4が同定される予定なのでそれぞれどのタイプを有するかも明らかにする。
Causes of Carryover	感染症の拡大により、参加および研究発表を予定していた国際会議が中止となってしまったため、旅費として計上していた額の大半が繰り越された。また、その他はMS解析の外注を想定していたが、非常事態宣言等により長期モニタリングが必要な菌体培養が難しかったため、解析サンプルを準備することができなかった。これらについては、2021年度に（オンラインを含む）学会発表およびMS解析の外注費として使用する予定である。