鉄代謝制御による細胞増殖制御機構とその生理機能の解明

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K15810
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 山内 隆好 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (60747624)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 細胞内鉄代謝 / 細胞増殖 / ユビキチンリガーゼ / FBXL5 / IRP2

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞内鉄量の変動が細胞増殖をもたらす分子機構の手がかりを得ることを目的とする。本年度はまず、①鉄代謝の上流制御因子であるFBXL5鉄レポーター細胞の作成・改良を行い、それらがスクリーニング実験に使用できるかどうかの評価を行った。問題ないことが確かめられたFBXL5鉄レポーター細胞へ幾つかの発現誘導ベクターの組み合わせを用い、ドキシサイクリン特異的Cas9誘導可能なFBXL5鉄レポーター細胞株を作成した。作成した数十種類の細胞株に対し、スクリーニング前のポジティブコントロールとしてFBXL5特異的なガイドRNAを導入しその有用性を試験した。実際にドキシサイクリン依存的なFBXL5とその下流因子（IRP2およびTfR1）の変化が想定通り認められた細胞株を選別して本番のスクリーニング用として保存した。その後、これら細胞株が蛍光アウトプットによるスクリーニングにも適するかどうかを再度確認する実験を行い、実際に細胞内鉄量依存的に蛍光レポーターシステムが変化し鉄量と蛍光強度に相関が認められる細胞株をフローサイトメトリーにて更に選別した。それら最終的に選定した鉄依存的レポーター細胞株へガイドRNAライブラリーをウイルスベクターで導入し個々の細胞で1つ1つランダムに異なる遺伝子を欠損させた後、蛍光強度の高いものと低いもの、それぞれ５％をフローサイトメトリーにて選択的に採取し、ゲノムDNAの精製と組み込まれたライブラリー遺伝子の情報を高速シーケンサーにより同定・解析した。解析結果、上位および下位5％にそれぞれ入っている事が想定される既知の鉄代謝関連因子群が得られなかった事から、各種条件検討の必要性が示唆された。しかしながら、本実験にて得られた候補遺伝子は、新規の鉄代謝関連増殖制御因子として今後細胞レベルにおいて検討する価値のあるものである事が考えられる。