2019 Fiscal Year Research-status Report
新規IPPT分子によるイネの免疫誘導と病徴発現の制御機構の解明
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19K15843
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
近藤 真千子 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 助教 (40645975)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 植物病原細菌 / エフェクター / イネ / 免疫 / 病徴 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物病原細菌Acidovorax avenaeのイネ非病原性N1141菌株のIPPTはイネの免疫反応を誘導するが、イネ病原性K1菌株のIPPTはイネの病徴を引き起こす。本研究ではIPPT分子によるイネの免疫誘導と病徴発現の特異的制御機構を分子レベルで明らかにすることを目的として研究を行った。
2019年度の研究では、まず、IPPTタンパク質のイネ細胞内への輸送機構について、イネ非病原性N1141菌株のIPPTとCyaAとの融合タンパク質を発現する菌株を作製して調べた。その結果、N-IPPTはイネ細胞内へ分泌されていることが明らかとなった。さらに、イネ非病原性N1141菌株のIPPTを一過的に発現させたプロトプラストやイネ培養細胞ではHR誘導やDNAの断片化が認められた。一方で、イネ病原性のK1菌株のIPPTはHRを誘導しなかったが、N1141菌株のIPPTを導入したイネ培養細胞に比べて約半分程度のDNA断片化が認められた。このことから、N-IPPTは非宿主に対して免疫反応誘導因子として働き、K-IPPTはイネ細胞内で過剰発現させた場合は弱いHR誘導能を持つ可能性が考えられた。さらに、N1141菌株のIPPTと相互作用するイネタンパク質について酵母Two-hybrid法で探索したところ、IP1、IP2、IP3と名付けた3種類のイネタンパク質を同定し、BiFC法を用いた実験により、これらの相互作用はイネ細胞内でも確認することができた。興味深いことに、これらのイネタンパク質はK1菌株のIPPTとは相互作用しなかった。このことから、N1141菌株のIPPTとK1菌株のIPPTはイネ細胞内で異なるイネタンパク質と相互作用し、免疫反応誘導や病徴発現を行っていることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度の研究では、N1141菌株のIPPTがイネ細胞内へ輸送されることを明らかにすることができた。また、輸送されたN1141菌株のIPPTはイネの細胞内でDNAの断片化を伴ったHRを誘導することも明らかにすることができた。さらに、N1141菌株のIPPTのイネ細胞内で相互作用する分子が明らかとなり、これらはK1菌株のIPPTとは相互作用しないことを明らかにすることができた。このことは、N1141菌株のIPPTとK1菌株のIPPTはイネ細胞内で異なるイネタンパク質と相互作用し、免疫反応誘導や病徴発現を行っていることを示す新たな知見となった。現在、IPPTと相互作用するイネタンパク質のイネ欠損体をCRISPR-Cas9系を用いたゲノム編集によってすでに得ることができている。また、N1141菌株とK1菌株のIPPTのそれぞれのDEX誘導型IPPT発現イネもすでに作製できた。これらの植物体を準備できたことで、今後、IPPTとイネタンパク質の相互作用によって誘導される免疫反応誘導や病徴発現にどのような遺伝子やタンパク質が働いているかを明らかにできると考えており、研究は予定通り進捗していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ゲノム編集によって得られたIPPTと相互作用するイネタンパク質のイネ欠損体を用いて、N1141菌株を接種した場合にHRが誘導されなくなることを確認する。また、DEX誘導型IPPT発現イネを用いて、IPPTを発現させた時にHRなどの免疫反応誘導や病徴発現が誘導されるかどうかも確認する。また、これらの植物体を用いて、IPPTとイネタンパク質の相互作用によって誘導される免疫反応誘導や病徴発現にどのような遺伝子やタンパク質が働いているかを明らかにするため、遺伝子発現やタンパク質発現の変化についてRNA-seqやマイクロアレイ解析、プロテオーム解析を行い、免疫反応誘導や病徴発現に関与する遺伝子の発現変化を明らかにする。また、IPPTタンパク質の酵素活性が過敏感細胞死や病徴発現に重要かどうかについて、IPPT遺伝子欠損酵母株を用いたtRNA-IPPT酵素活性相補実験やIPPTスワップ変異体のイネへの接種実験によって明らかにする。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究で、両菌株のIPPTと相互作用するイネタンパク質が同じ場合は、それらの結合量について高分解能オービトラップ質量分析計、LCIT-TOF-MS、Biacoreで解析し、相互作用に差があるかを明らかにする予定だったが、相互作用するイネタンパク質が異なることが明らかとなったため、これらの解析に使用する費用が不要となった。一方、本年度の研究で欠損イネや誘導発現型イネなどを作製できたため、これらの植物体を用いたRNA-seqやマイクロアレイ解析に使用するための費用を次年度使用額として計上することになった。また、現在執筆中の英語論文の論文投稿費に支出する予定である。
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