スルメイカ視神経節において発現するアスパラギン酸ラセマーゼに関する研究

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K15911
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 小山 寛喜 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (20746515)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: D-アスパラギン酸 / アスパラギン酸ラセマーゼ

Outline of Annual Research Achievements

頭足類の神経系には多量のD-アスパラギン酸が存在し、神経伝達物質としての機能が示唆されている。スルメイカTodarodes pacificusの視神経節では全アスパラギン酸の約50%がD体であることや、マダコOctopus vulgarisの視神経節においては全アスパラギン酸の90%以上がD体であることが明らかとなっている。これらD-アスパラギン酸はアスパラギン酸ラセマーゼと呼ばれる酵素によってL体から生合成されていると考えられているが、アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子は少数の生物においてのみ明らかになっているに過ぎない。
したがって本研究では、頭足類神経系からのアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子クローニングを目的とした。試料として用いたのは、入手のし易さなどの観点からスルメイカとした。スルメイカ視神経節からアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子の候補がクローニングされたが、大腸菌などの様々な発現系を用いてリコンビナントタンパク質発現を行ったものの、すべてにおいて活性は得られなかった。したがって、新たなアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子候補の探索が必要と考えられ、発現クローニングを行うことにした。発現クローニングとはスルメイカ視神経節で発現している遺伝子を動物細胞などにすべて発現させた後、アスパラギン酸ラセマーゼ活性を追うことで最終的にアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子を単離する方法である。
はじめにスルメイカ視神経節由来のcDNAライブラリーの作製および分割を行った後、小麦胚芽抽出液を用いて無細胞系での発現を行った。現在、発現したタンパク質にL-アスパラギン酸と補酵素を加え、高速液体クロマトグラフィーによりD-アスパラギン酸の検出を試みているが、まだ活性は検出されていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

スルメイカ視神経節由来のcDNAライブラリーを作製し、サイズを計測したところ約36,000クローンであった。発現クローニングを行うためのサイズとしては小さなものであったが、このライブラリーを用いて実験を行った。まず、ライブラリーを約500クローンずつに分割し、小麦胚芽抽出液を用いてタンパク質発現を行った。それぞれの発現タンパク質溶液にL-アスパラギン酸および補酵素としてピリドキサール5’-リン酸を加え、37℃で一晩のインキュベートを行った。反応終了後、高速液体クロマトグラフィーを用いてD-アスパラギン酸の検出を試みた。現在までに、計30,000クローンにおいて上記の方法で活性測定を行ったが、活性はまだ検出されていない。したがって、これまで活性測定に供した計30,000クローンのなかには、目的とするアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子は含まれていないものと考えられる。
当初の研究計画より遅れることとなった理由としては、発現クローニングを行うためには、充分なサイズのライブラリーを作製する必要があるが、そのライブラリーの作製に時間を要したためである。

Strategy for Future Research Activity

現在、スルメイカ視神経節から作製された約36,000クローンのcDNAライブラリーを用いて、発現クローニング法によりアスパラギン酸ラセマーゼ活性を測定中である。これまで、約30,000クローンにおいてタンパク質発現およびアスパラギン酸ラセマーゼ活性測定を行ったが、未だ活性は検出されていない。今後はまず、残りの約6,000クローンにつき活性測定を行う。活性が検出された場合には、ライブラリーをさらに細分化しアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子の単離を試みる。
全36,000クローンにおいて活性が検出されなかった場合は、ライブラリーサイズが小さいことが原因の一つと考えられるため、よりサイズの大きなライブラリーの作製を行う。一般的に発現クローニングには1,000,000クローン以上のサイズが理想的とされているので、そのサイズのライブラリーの再構築を試みる。新たなライブラリー作製の際に、試料として用いるスルメイカ視神経節は既に入手しているため、すぐに開始できる状態である。
また、今回の発現クローニングでは、小麦胚芽抽出液による無細胞系でタンパク質を発現させたが、ライブラリー作製に用いたベクターは動物細胞発現にも対応するため、動物細胞を用いた発現クローニングも今後検討する。
アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子単離後は、塩基配列の解析を行い、他生物種の各種アミノ酸ラセマーゼとの分子系統関係を詳細に調べる。さらに、明らかとなった塩基配列をもとに他の頭足類や哺乳類などのアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子同定を試みる。
次に、大腸菌発現により得られたリコンビナントアスパラギン酸ラセマーゼを用いて最適pHや最適温度などを調べ、酵素学的特徴を明らかにする。また、活性中心と予想されるアミノ酸を置換させ、酵素活性にどのような影響が生じるのかを調べ、酵素活性に重要なアミノ酸残基を特定する。

Causes of Carryover

当初は、令和2年度中にcDNAライブラリーを作製し、発現クローニング法によりアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子を単離する予定であったが、cDNAライブラリーの作製が困難であり、時間を要してしまった。現在は作製したライブラリーを用いて、アスパラギン酸ラセマーゼ活性の検出を行っている段階であり、遺伝子の単離までは進んでいない。したがって、遺伝子単離後の実験費用として計上した予算が使えず次年度使用額が生じた。
令和3年度も引き続き発現クローニングを行うので、次年度使用額をその費用として用いる。また、今年度予算は当初の予定通り、生化学実験関連試薬や実験系プラスチック類などの購入費用として用いる予定である。