2022 Fiscal Year Annual Research Report
スルメイカ視神経節において発現するアスパラギン酸ラセマーゼに関する研究
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19K15911
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
小山 寛喜 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (20746515)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | D-アスパラギン酸 / アスパラギン酸ラセマーゼ / スルメイカ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
頭足類の神経系には多量のD-アスパラギン酸（Asp）が蓄積し、神経伝達物質としての機能が示唆されている。スルメイカTodarodes pacificusの視神経節においては全Aspの約50%がD体であることが明らかとなっている。D-Aspはアスパラギン酸ラセマーゼ（AspRase）と呼ばれる酵素によってL体から生合成されるが、その遺伝子は少数の生物においてのみ明らかになっているに過ぎない。
そこで本研究では、スルメイカを試料として用い、その視神経節からAspRase遺伝子のクローニングを試みた。その結果、スルメイカ視神経節からAspRase候補遺伝子がクローニングされたが、大腸菌などの様々な発現系を用いたリコンビナントタンパク質として発現を行ったものの、すべてにおいて活性は検出されなかった。したがって、新たなAspRase候補遺伝子の探索が必要と考えられ、発現クローニングを行った。
はじめに、スルメイカ視神経節由来のcDNAライブラリーの作製および分割を行った。分割後、小麦胚芽抽出液を用いて無細胞系での発現を行い、各プールにおけるアスパラギン酸ラセマーゼ活性を測定したが、活性の検出には至らなかった。発現クローニング法によるAspRase遺伝子探索も困難であったため、RNA-Seq解析を行い、スルメイカの視神経節において発現している遺伝子を網羅的に調べた。その結果、新たなAspRase候補遺伝子が発見された。その候補遺伝子を大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質として発現を行ったところ、可溶化が確認された。さらに、L-Aspを基質とした酵素反応を行った結果、D-Aspの生成も認められた。これらの結果から、新たにクローニングされた遺伝子はスルメイカのAspRase遺伝子であると結論付けられた。今後は、スルメイカAspRaseのより詳細な性状について調べる予定である。
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