根の環境応答による液胞動態変化に伴う物質輸送の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K15949
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 中山 真由美 東北大学, 農学研究科, 特任助教 (70814317)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 環境応答

Outline of Annual Research Achievements

環境ストレス応答における液胞の役割解明の糸口として，シロイヌナズナ根で確認される液胞動態変化に伴う物質輸送を明らかにすることを目的に，(1)，(2)の研究を実施した。
(1) 根冠プロテオーム解析による液胞動態変化に関与するタンパク質の同定：環境ストレス下におけるシロイヌナズナ根冠のタンパク質発現解析ため水分勾配刺激および浸透圧刺激時のタンパク質を調製，質量分析を行う根冠プロテオーム解析と並行して，既に予備検討で取得していた水分勾配刺激処理時のプロテオーム解析データに既知のマイクロアレイ解析データを加えて検証を行い，根冠が環境ストレスを回避し液胞が収縮する際に特異に機能する可能性のある候補タンパク質リストを作成した。作成したリストの候補のうちトランスポーターまたは膜局在と予測される8タンパク質については，(2)の候補遺伝子として活用した。
(2) 液胞への取り込みおよび排出に関わるトランスポーターの探索と輸送基質の同定：公共データベースや文献情報，学会での調査により，シロイヌナズナにおいて液胞膜への局在，あるいはトランスポーターとして機能すると予測されるものから探索モデルとして19遺伝子を絞り込み，そのうち根冠での発現が確認される遺伝子を優先して大腸菌および出芽酵母での過剰発現系構築を進めた。これらの構築した候補遺伝子を過剰発現する形質転換体の取得により，次年度に向けて，候補タンパク質による基質の取り込みと排出の有無を確認，蛍光試薬等を用いた液胞動態の形態学的な検証の実施準備が整った。 また，(1)によって絞り込んだ候補遺伝子についても同様に過剰発現系を構築した。これら候補の中にはトランスポーター以外の膜タンパク質も含まれており，関連する研究協力先との研究実施の調整や解析手法等を検討している。引き続き，液胞動態に変化をもたらす因子を絞り込み，検証を進める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

(1) 今年度予定していたプロテオーム解析はサンプル調製後に質量分析装置故障のため実施延期を余儀なくされたが，予備検討のデータ，データベース等を用いた候補の絞り込みおよびリスト作成を並行して実施することにより，進捗に大きな影響が出ることなく，候補タンパク質についての検証を(2)で実施するに至っている。
(2) 探索モデル候補遺伝子の絞り込みが終了し，次年度に実施する予定の研究準備が整った。(1)から得られた候補については計画を前倒して今年度から実施することができ，候補から派生する新たな解析準備のため，研究協力先での研究実施調整を進めている。
計画通り(1)では候補タンパク質リストを作成し，(2)では探索モデル候補について次年度に検証を実施できる進捗状況であり，おおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

(1) 根冠プロテオーム解析による液胞動態変化に関与するタンパク質の同定：液胞動態変化に関与する候補タンパク質リストを作成し，(2)での候補として活用したが，延期となった浸透圧刺激時の根冠のプロテオーム解析については次年度に再度サンプル調製および分析を行い，水分勾配刺激のプロテオーム解析結果との比較，検証することより，候補タンパク質リストの精度を高める。
また，今後(2)において得られる結果をフィードバックすることにより，作成リストの有効性についても検証する。
(2) 液胞への取り込みおよび排出に関わるトランスポーターの探索と輸送基質の同定：計画通り探索モデル候補遺伝子について，構築を進めた候補を過剰発現する大腸菌，出芽酵母を用いることにより，候補タンパク質による基質の取り込みと排出の有無を確認，蛍光試薬等を用いた液胞動態の形態学的な検証を行う。 また，(1)によって絞り込んだ候補についても同様に検証を進める。候補の中にはトランスポーター以外の膜タンパク質も含まれているが，液胞の動態変化には多くの膜タンパク質が関わると考えられるため，これらについても解析を進める方針である。
(1)，(2)の推進により，液胞動態に変化をもたらす因子を絞り込み，液胞で機能するトランスポーターを含む膜タンパク質や輸送される基質を同定する。

Causes of Carryover

(1) 実施を計画していたプロテオーム解析に使用する質量分析装置が故障し，分析実施が延期となったため，これらの解析にかかる物品費(ラベリング試薬等)，装置使用料が次年度使用額として生じた。次年度に，今年度作成した候補タンパク質リストの精査のため，再度浸透圧刺激処理時のプロテオーム解析の実施を計画している。
(2) 実施を計画していた研究協力先での研究実施が新型コロナウイルスの影響で延期となったため，これらにかかる旅費，物品費が次年度使用額として生じた。次年度に延期となった研究協力先での研究実施を計画している。