根の環境応答による液胞動態変化に伴う物質輸送の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K15949
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 中山 真由美 東北大学, 農学研究科, 特任助教 (70814317)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 環境応答

Outline of Annual Research Achievements

環境ストレス応答における液胞の役割解明の糸口として，シロイヌナズナ根の液胞動態変化に伴う物質輸送を明らかにすることを目的に，(1)，(2)の研究を実施した。
(1) 根冠プロテオーム解析による液胞動態変化に関与するタンパク質の同定：シロイヌナズナ根冠のプロテオーム解析として，予備検討で取得していた水分勾配刺激処理時のプロテオーム解析データに既知のマイクロアレイ解析データを加えて検証し，根冠が環境ストレスを回避し液胞が収縮する際に特異に機能する可能性のある候補タンパク質リストを作成，トランスポーターまたは膜局在と予測される8タンパク質を(2)の候補遺伝子として活用した。加えて，浸透圧刺激による液胞動態変化時の根冠プロテオーム解析を行い，同様に候補タンパク質リストを作成し，新たに(2)の候補遺伝子として活用した。
(2) 液胞への取り込みおよび排出に関わるトランスポーターの探索と輸送基質の同定：公共データベース等を活用して，シロイヌナズナにおいて液胞膜局在，あるいはトランスポーターとしての機能が予測されるものから探索モデルとして19遺伝子を絞り込み，そのうち根冠で発現が確認される10遺伝子を優先，(1)の候補遺伝子と共に，大腸菌および出芽酵母での過剰発現系構築を進めた。大腸菌では，発現を確認した候補について，それらの培養液を質量分析することで輸送物質を推定した。出芽酵母では，候補遺伝子を過剰発現する形質転換体について候補タンパク質による基質の取り込みと排出の有無の確認や，蛍光試薬等を用いた液胞動態の形態学的な検証を行う。これらの候補にはトランスポーター以外の膜タンパク質も含まれており，関連する研究協力先との研究実施調整や解析手法等を検討している。引き続き，液胞動態に変化をもたらす因子の絞り込みと検証を進める。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

(1) 計画通り候補タンパク質リストを作成できたが，予定していたプロテオーム解析が質量分析装置故障および代替装置の導入時期の影響により遅延し，(2)の新たな候補の絞り込みの時期が後ろにずれ込む状況となった。
(2) (1)の遅延に伴い，候補遺伝子の解析が遅延した。先行する探索モデル候補遺伝子については，計画していた解析は順調に進んでいるものの，各々の候補の特性から派生した解析や検証が新たに必要となり，研究協力先での研究実施を計画している。

Strategy for Future Research Activity

(1) 根冠プロテオーム解析による液胞動態変化に関与するタンパク質の同定：液胞動態変化に関与する候補タンパク質リストを作成し，(2)での候補として活用したが，より有効なデータを得るため，再現性を検証するプロテオーム解析を行う。 また，作成リストの有効性については，今後(2)において得られる結果をフィードバックすることにより検証する。
(2) 液胞への取り込みおよび排出に関わるトランスポーターの探索と輸送基質の同定：引き続き，構築を進めた候補を過剰発現する大腸菌，出芽酵母を用いることにより，候補タンパク質による基質の取り込みと排出の有無を確認，蛍光試薬等を用いた液胞動態の形態学的な検証を進める。 候補にはトランスポーター以外の膜タンパク質も含まれているが，液胞の動態変化には多くの膜タンパク質や因子が関わると考えられるため，これらの関連因子を含めた解析を進める方針である。
(1)，(2)の推進により，液胞動態に変化をもたらす因子を絞り込み，液胞で機能するトランスポーター，膜タンパク質を明らかにする。

Causes of Carryover

(1)で実施を予定していたプロテオーム解析に使用する分析装置について，当初使用予定装置と比較してより本研究課題の解析に適した新たな装置が今年度後半に導入される見込みとなり，解析を延期したためこれらの解析にかかる物品費，装置使用料が次年度使用額として生じた。次年度には作成した候補タンパク質リストの精査のため，再度プロテオーム解析の実施を計画している。
(2)で昨年度末から実施を予定していた研究協力先での研究実施が新型コロナウイルスの影響で延期を余儀なくされたため，これらにかかる旅費，物品費が次年度使用額として生じた。次年度に延期となった研究協力先での研究実施および代替となる解析を計画している。