2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K15967
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
井上 弘貴 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 特任研究員 (20807812)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 生殖細胞 / GS細胞 / 精子発生 / RNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
精子幹細胞を含む精原細胞集団の維持、分化制御は精子生産能力に直結する重要な機構である。NANOS3はNanosファミリーに属するRNA結合タンパク質であり、NGN3陽性細胞で発現することが分かっている。これまでの申請者らの解析から、精原細胞におけるNANOS3の欠損は未分化型精原細胞の分化を促進する転写因子STRA8の脱抑制およびNGN3陽性細胞の減少を引き起こすことが分かっている。そのため、NANOS3はNGN3陽性細胞の分化の抑制を行うことで未分化型精原細胞の適切な増殖に寄与していると考えられる。しかしながら、生体内では未分化型精原細胞は少数しか存在しておらずNANOS3の分子機構についての解析は容易ではなかった。本研究ではこの問題を解決するために、NANOS3欠損GS細胞を用いNANOS3の分子機能解析を行う。
本年度はまず、4-OHTの添加によりNANOS3を欠損するGS細胞を樹立し、解析を行った。解析の結果、NANOS3欠損GS細胞では増殖速度が著しく低下した。また、生体内と同様STRA8の発現が上昇していることが確認されたことから、生体内での結果と同様、NANOS3はGS細胞においても分化を抑制する機能を有することが示唆された。今後、RNA-seqによる転写産物の網羅的な解析により、NANOS3が関与する分化制御の機構に迫っていく。
また、並行して行っている、NANOS3の相互作用因子の探索により、すでに相互作用が報告されているCNOT複合体に加え多数の因子を同定している。今後その中から、候補因子の絞り込みを行っていくことで、NANOS3分子機構の重要なパートナー因子を同定していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
年次計画通り、NANOS3欠損GS細胞の樹立し解析を行った。NANOS3欠損GS細胞は増殖速度が低下することから、GS細胞の維持にNANOS3が重要な機能を有していることが示唆された。しかしながら、同じファミリーのNANOS2欠損GS細胞とは異なり、増殖能が低下しながらも維持されたことから、NANOS3はGS細胞の維持に必ずしも必須ではないと考えられた。この結果は、精原細胞での結果と類似しており、GS細胞においても生体内と同様の機能を有する可能性が示唆された。加えて、NANOS3欠損GS細胞ではStra8 のmRNAおよびタンパク質の発現が上昇すること、STRA8を発現する、形態的に異常な細胞が増加することから、NANOS3欠損GS細胞ではSTRA8を強発現し、分化した細胞へと移行している可能性が考えられる。またこの仮説を支持するデータとしてc-kitなどの分化マーカーのmRNA発現もNANOS3欠損GS細胞で発現上昇していること示唆されている。
並行して行っている計画として、IP-MASS解析によりNANOS3相互作用因子を網羅的に探索した。FLAGタグ付きNANOS3を発現するGS細胞とネガティブコントロールとしてFLAG-NANOS3を欠損したGS細胞を使用し、FLAGに対する免疫沈降を行い、得られた産物をMASS解析に供した。既報の通り、mRNAの脱アデニル化に関与するCNOT複合体が同定された他、翻訳、スプライシング、mRNA輸送に関与する多数のRNA結合タンパク質が同定された。NANOS3が生殖細胞特異的なRNA結合タンパク質であるため、いくつかのクライテリアを設定しNANOS3のパートナー候補因子を6つまで絞り込んだ。この６つの因子についてはGS細胞のcDNAからクローニングを行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度まで、おおむね計画通り進行しており、今後も計画の通り解析を続けていく。具体的にはNANOS3欠損GS細胞のRNA-seq解析により、発現変動遺伝子を網羅的に同定し、NANOS3の標的RNAにNANOS3とその相互作用因子がどのように働き分化の抑制に機能するのかに着目して更なる解析を行っていく。
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| Causes of Carryover |
NANOS3を欠損したGS細胞の表現型が当初想定していたものよりもシビアなものであったことから、表現型が出始めるのはいつかRNA-seqを行う前にRT-PCR等で条件検討を行った。そのため初年度に行う予定で計上したRNA-seqを、次年度に行うこととしたため。
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