2019 Fiscal Year Research-status Report
Identification and diagnostic application of rabies virus latent infection site using high sensitivity bioimaging method
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19K16001
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
君付 和範 大分大学, 医学部, 助教 (10829724)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 狂犬病 / 高感度生体イメージング / AkaLuc / RFLuc / 1088株 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、野外株低用量接種により長く不定な潜伏期を再現したマウスモデルを使用して、潜伏期間中のウイルスの局在の特定、さらに潜伏部位における遺伝子変動を解析することを目的としている。これに加え、フィリピンにおける発症犬の唾液中に含まれるウイルス量の調査を実施する。本年度は、研究実施計画に沿って、以下の研究を実施した。
まず、潜伏期間中のウイルス感染動態観察に適した組換えウイルスの比較検討に関しては、AkaLuc発現組み換え狂犬病ウイルス1088株（1088/AkaLuc）の作出に成功した。さらに1088/AkaLucもしくは、RFLuc発現組み換え狂犬病ウイルス1088株（1088/RFLuc）をマウスの後肢筋肉内に高用量接種（5x10^6FFU/mouse）した後、1088/RFLuc感染マウスにはD-ルシフェリンを、1088/AkaLuc感染マウスにはアカルミネをそれぞれ腹腔投与し、in vivoイメージング装置下にて、発光シグナルを検出した。その結果、AkaLucシステムでは、接種1日目に肝臓で自家蛍光接が認められたが、接種3日目以降は脳と脊髄内へのウイルスの感染を確認できた。シグナル検出の強さはAkaLucシステムの方が、RFLucシステムよりも少し強いことが判明した。また、D-ルシフェリン、アカルミネをそれぞれ1088/RFLuc接種マウスと1088/AkaLuc接種マウスに接種したところ、1088/AkaLucではD-ルシフェリンを使えないが、1088/RFLucはアカルミネ、D-ルシフェリンの両方の基質を使えることが確認された。
発症犬の唾液中に含まれるウイルス量の調査に関しては、今年度は狂犬病発病犬の唾液サンプルを入手できなかったため、実施していない。そのため、発症動物の脳を用いて、real time RT-PCRによる解析の予備検討のみを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
潜伏期間中のウイルス感染動態観察に適した組換えウイルスの比較検討に関しては、本年度は、1088/AkaLucの作成に成功し、1088/RFLucと1088/AkaLucの比較実験を行うことができたことから、計画通りに進んでいると考える。狂犬病発症犬の唾液中に含まれるウイルス量の調査に関しては、３カ年での達成を予定している。そのため、サンプル入手時には、すぐに解析に取り掛かれるよう準備を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、低用量（10^3 感染価以下、必要に応じて唾液中のウイルス量を参考にする）の組換えウイルス（1088/RFLucもしくは1088/AkaLuc）をマウスに末梢感染させ、発光シグナル検出を比較検討する。また、NanoLuc発現組み換え狂犬病1088株（1088/NLuc）も比較対象に加え、これらの組み換えウイルスの中から、潜伏期間の解析に適した株をマウスに末梢感染させ、経日的にイメージングを行い、まずその感染動態を発症に至るまで観察する。感染ルートについても、前肢・後肢の筋肉内接種や背部からの皮下接種等の複数のルートを検討する。上記の観察で感染動態と感染ステージが把握できたら、再び感染実験を行ってイメージング解析を行い、潜伏中と推定される組織のウイルス（核酸）を高感度in situ hybridization法により、感染細胞については細胞マーカー用いた免疫染色により潜伏期間中の細胞を同定する。
発症犬の唾液に含まれるウイルス量の調査に関しては、次年度以降もサンプルの受け入れを続け、サンプルを入試したら直ちに解析できるよう体制を整えるる予定である。
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