Investigation on a role of activation-induced cytidine deaminase (AID) for development of enzootic bovine leukosis

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16008
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 西森 朝美 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, 研究員 (80817578)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 牛伝染性リンパ腫 / 腫瘍発症機序 / B細胞 / AID

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ウシのB細胞性リンパ腫である牛伝染性リンパ腫（BL）の発病リスク因子の解明を目的として突然変異誘導酵素AIDの発現・機能解析を実施する。今年度は、野外で発生したBL臨床検体を用いたゲノム中ウリジンの検出、BL症例におけるAID遺伝子多型の解析、癌関連遺伝子での点変異解析手法の構築と改良を実施した。
昨年度に構築したゲノム中ウリジン検出系を用いて、BL発症検体および腫瘍非発症検体におけるウリジン量の比較を行った。その結果、両検体ともにゲノムDNA中に含まれるウリジン量は非常に低値であり、BL発症検体におけるゲノム中ウリジンの上昇はみられなかった。また、野外発生したBL症例10頭についてAID遺伝子のタンパク質コード領域における多型の有無を解析したところ、すべてリファレンス配列と一致したため発症牛に特徴的な多型は認められなかった。
昨年度の研究計画変更に従って、癌関連遺伝子における点変異解析手法の構築を行った。p53遺伝子をはじめとするヒトB細胞腫瘍で変異頻度が高い9遺伝子を選択し、プライマーセットの設計、PCR増幅、次世代シークエンサーを用いたアンプリコンシークエンスを実施した。少数検体で検討した結果、9遺伝子のエキソン領域配列を簡便に決定することができたが、プライマー設計部位やPCR増幅反応の一部に改良点が見つかったため再度条件の見直しを行った。現在、対象遺伝子を21遺伝子に拡大して最終的な点変異解析手法の構築を実施している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当所の研究計画にあった（１）BL臨床検体におけるゲノム中ウリジン量の解析および（２）AID遺伝子多型の検索は終了し、AID遺伝子多型の機能試験については解析症例で多型が認められなかったため実施しなかった。最終年度から前倒しに計画変更した癌関連遺伝子の点変異検索においても、21遺伝子を標的としたアンプリコンシークエンス手法を確立できつつあるため、最終年度までに計画している解析内容はすべて終了できる予定である。

Strategy for Future Research Activity

今年度までの結果から、BL発症牛におけるAID遺伝子の高発現や機能上昇といった腫瘍発症でAIDの関与を示唆する結果は得られていない。最終年度に実施する癌関連遺伝子での点変異解析では、後天的変異の抽出および変異様式の解析によりAIDが主導するC→U（T）変異の出現頻度を明らかにすることで、発症までの長い経過にAIDが機能した際の“履歴”を評価し、AIDが腫瘍発症のスイッチとして機能するかという当研究課題の問いを検証することが可能である。解析の結果、AIDの関与が証明されなかった場合も、BL症例において変異様式を詳細に調べた報告はほとんどないため、BL発症の病態機序を解明するうえで有用な知見を提供できる。

Causes of Carryover

アンプリコンシークエンスの受託解析に使用する予定であったが、点変異解析手法でのPCR増幅反応等の条件検討を優先する必要があったために未使用額が生じた。確立した点変異解析手法を用いて、最終年度にBL臨床検体を用いたアンプリコンシークエンス解析を実施するため、未使用額をその経費に充てる予定である。