カニクイザルES細胞を用いた成熟卵子の試験管内誘導

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16013
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 茂谷 小百合 京都大学, 高等研究院, 特定研究員 (30792428)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: カニクイザル / 生殖細胞 / 再構成卵巣

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに、雌カニクイザルES細胞株において、始原生殖細胞（PGC）マーカー遺伝子（TFAP2C）と後期生殖細胞マーカー(VASA)の発現領域下でEGFPおよびtdTomatoを発現するレポーター株（TFAP2C-EGFP, VASA-tdTomato）を作製していた。この細胞を起点としヒト卵原細胞様細胞誘導系に倣い、カニクイザル生殖細胞の誘導を試みた。具体的には、カニクイザルPGCLC（TFAP2C-EGFP+）と雌のマウス胎児（(Embryonic day）E12.5）生殖巣由来の体細胞で構成された細胞塊を作製、長期培養した（以下、再構成卵巣法とする）。しかし、これだけでは卵原細胞様細胞（TFAP2C-TGFP+, VASA-tdTomato+）は得られても、それより先の生殖細胞（TFAP2C-RGFP-, VASA-tdTomato+）の誘導には不十分であった。
本年度は、カニクイザル始原生殖細胞様の細胞（PGC-like cell, PGCLC)から発生した卵原細胞様細胞の分化をさらに進めるため、再構成卵巣法の改善に取り組んだ。その結果、卵原細胞以降の細胞（TFAP2C-EGFP-, VASA-tdTomato+）と思われる細胞を得ることができた。現在、この細胞の性状を確認している。今後、性状解析により分化段階が確定すれば、成熟卵子へ向けて分化誘導するための培養条件の決定に取り組む予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究計画書では、本年度までに成熟卵子誘導系の樹立を完了している予定としていたが、実際には再構成卵巣法を改善に取り組んだ。これまでに、再構成卵巣法による誘導には長期培養（１１週～１５週程度）により、PGCLC由来の細胞の生存率が低下することが大きな問題となっていた。卵原細胞より先の細胞へ誘導するためには、長期間であっても、状態の良い細胞を維持する必要があった。１年間かけて培養条件を検討し、細胞が生きた状態で卵原細胞以降の細胞（TFAP2C-EGFP-, VASA-tdTomato+）へ誘導する条件を決めることができた。現在、この細胞の分化段階を確定するため性状解析を行っている。

Strategy for Future Research Activity

まず、上記の性状解析により現在の培養法でどこまで分化誘導できるのか確定する必要がある。具体的には、RNAシーケンス法によるトランスクリプトーム解析、bisulfiteシーケンス法を用いた全ゲノムリプログラミングの有無の特定を予定している。分化段階が決定次第、成熟卵子誘導系の樹立に着手する。

Causes of Carryover

研究計画の遅延により、当初予定していた消耗品の購入を見送ったため。また、学会への参加も中止したので、学会参加費用、旅費も必要でなくなったため。