間葉系幹細胞の血管新生機構解明による細胞単離／濃縮技術の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16018
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 渡邊 朋子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (70827980)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / MSC / 血管新生

Outline of Annual Research Achievements

本研究では高い血管新生能を示す間葉系幹細胞(MSC)株で機能する分泌因子／転写因子ネットワークを解明し、高血管新生能MSCの単離／濃縮システムの開発を目指す。近年MSCを用いた血管新生／再生療法が虚血性疾患に対して治療効果を示すことが報告されており、その臨床研究が進められている。しかしながらMSCは株ごとに血管新生能が異なり、思い通りの治療成績をあげられないという課題がある。またMSCが血管新生を亢進する分子的機構についても不明な点が多く残されている。そこで本研究では1)in vitro血管新生モデルを利用しその能力が高い／低いMSC株を特定する、2)プロテオーム解析により血管新生に寄与する因子を特定する、3)非侵襲的なソーティングにより高血管新生能細胞の分離システムを確立する。以上の研究により、MSCの血管新生機構解明による新たな単離／濃縮システムの開発を目指した。

今年度の研究では、血管内皮細胞を用いたin vitro血管新生能評価モデルを用いて、由来の異なる複数種類のMSC株の血管新生能を評価した。さらに各細胞株の培養上清を用いたプロテオーム解析を行った。その結果、高血管新生能を持つ細胞株で特異的に発現する因子を同定し、その中から血管新生に寄与する因子を複数同定した。現在はMSCによる血管新生機構の解明を進めると共に非侵襲的な高血管新生能MSCの単離／濃縮技術の開発を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在までに以下の２点について主に研究を行った。(1) MSCの培養上清の持つ血管新生能を評価可能なin vitroモデルを構築した。血管内皮細胞の培養条件を検討することで、不完全な血管構造が構築される条件を見出し、MSCの培養上清を添加した際の血管構造の回復度合いから、血管新生能を評価出来る系を構築した。位相差画像から解析ソフトにより血管構造を線形化して画像解析を行い、評価の項目としては血管の全長、血管の分岐ポイント数、血管の網目構造の面積を設定して定量化した。(2) (1)のin vitro血管新生能評価モデルを用いてMSCの血管新生に寄与する主要因子を同定した。由来の異なるMSC株の培養上清を利用して血管新生能を評価し、プロテオーム解析により発現タンパク質の比較解析を行った、その結果、高血管新生能を持つ細胞株で特異的に発現するタンパク質、あるいは細胞株の持つ血管新生能とそのタンパク質発現量の間に正の相関が見られるものの中から、血管新生に寄与する因子として２種類のシグナル関連因子を特定した。in vitro血管新生能評価モデルにおいて、同定した２種類のシグナル関連因子のリコンビナントタンパク質を添加したところ、顕著に血管新生が促進される様子が見られた。現在は高血管新生能MSCの単離／濃縮技術の開発を見据えた、２種類のシグナル関連因子による血管新生機構の解明を行っている。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度は以下の研究を計画している。新規に同定した高血管新生能マーカーを用いてMSCの単離／濃縮システムの開発に向けた実験を開始する。細胞を単離し、目的抗原(高血管新生能マーカー)に対する磁気抗体を用いたセルソーティングを行い、目的細胞のみを選別する。選別した細胞をプレートに播種し、増殖が十分に見られたウェルを選択し、凍結ストックの作製を行う。これらの手法により非侵襲的な細胞濃縮法の確立を目指す。

Causes of Carryover

当初の予定よりも消耗品にかかる費用が抑えられたため。