2019 Fiscal Year Research-status Report
in vivo インタラクトーム解析を革新する BioID マウスモデルの開発
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19K16019
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
村田 知弥 筑波大学, 医学医療系, 助教 (60713485)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / in vivo BioID |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体においてタンパク質は、様々なタンパク質と相互作用することにより、細胞・組織機能を調和的に制御している。古くから培養細胞レベルでのタンパク質間相互作用の網羅的解析（＝インタラクトーム解析）は行われているが、生体組織 (in vivo) においては技術的な問題が多く存在し、成功例は少ない。本研究では、近年開発された「近位依存性ビオチンラベリング (BioID) 」と呼ばれる手法を用い、マウス組織におけるインタラクトーム解析技術を確立する。
現在までに、概日リズム制御因子 BMAL1 にビオチンリガーゼ (BirA*)を融合した BMAL1-BioID の発現ベクターを作製し、培養細胞系において BMAL1-BioID タンパクが核に局在し、ビオチン化能を有することを確認した。さらに ROSA26 遺伝子座に BMAL1-BioID をノックインしたマウスを作製し、in vivo BioID アッセイを行ったところ、ビオチン投与によるビオチン化タンパクの蓄積は認められなかった。一方、BMAL1-BioID ノックインマウス由来の線維芽細胞を用いて in vitro にて BioID アッセイを行ったところビオチン化タンパクの蓄積が認められた。この結果から、in vivo ではビオチンリガーゼの活性や、ビオチンの投与法について改善が必要であることが判明した。また、BMAL1 に加えて、多様な細胞内局在を示すビオチンリガーゼ融合遺伝子の発現ベクターを作製し、培養細胞系において、細胞内局在の確認とオチン化能の確認を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
種々のビオチンリガーゼ融合遺伝子のクローニングと、培養細胞系における評価、またBioIDノックインマウスの作製まで計画通りに遂行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vivo BioIDアッセイにおいて実験系の改善が必要であることが判明したが、計画調書に記載の通り、活性の高いビオチンリガーゼを用いて引き続き検証を行う。また、多様な細胞内局在を示すビオチンリガーゼのノックインマウスの樹立も実施していく予定である。
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