ミトコンドリアDNA量制御の時間生物学モデルの開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16033
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 山口 碧 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術支援センター, 基盤技術研究職員 (20593643)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ミトコンドリアDNA / ミトコンドリアDNA量 / マウス

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリアDNA（mtDNA）は合成系、分解系のそれぞれの制御を受け、そのバランスにより量が規定されている。このシステムの破綻がミトコンドリア機能を低下させることは、代謝性疾患、神経変性疾患などの様々な疾患との関わりから示されており、詳細な分子メカニズムの理解が重要と考えられる。
これまでに、時間生物学的なmtDNA量の制御機構についての理解を目的として、一定の時間間隔で採取したマウス組織由来のmtDNA量を定量的に解析した。その結果、特定組織のmtDNA量が時間依存的に変動していることを明らかにした。また、mtDNAの複製に関与する複数の核遺伝子の発現量についても一部の組織で日内変動が認められた。
本年度は、mtDNA量を規定する複製・分解機構と分子時計がどのように相互に関与しているのか、またその生理学的意義を個体レベルで明らかにするために、CRISPR/Cas9システムを用いて時計遺伝子欠損マウスの作製に着手した。高効率の変異導入を実現する標的gRNAを選定するために、Cas9タンパク質と複数の候補gRNAの複合体をエレクトロポレーション法によってマウス受精卵に導入した。エレクトロポレーション後の胚は胚盤胞期まで体外培養により発生させ、PCR法等によりターゲット領域を解析した。その結果、70％程度の高い変異導入率が認められたため、次年度はこの標的gRNAを用いて時計遺伝子欠損マウスの樹立を目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

みかけのmtDNA量の分子時計による制御と、その生理学的意義を個体レベルで明らかにするために、本年度では時計遺伝子のノックアウト（KO）マウスの作製を実施する予定であったが、新型コロナウイルスの感染防止対策等の対応によりエフォートを本申請に分配することが困難となり、申請時の計画より進捗が遅れた。今年度実施予定であった当初の研究計画を次年度からの2年間で遂行できるよう、早急に研究計画の再検討を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

本年度に高い変異導入効率を確認した標的gRNAを用いて時計遺伝子欠損マウスの作製、解析、繁殖を行う。樹立した時計遺伝子欠損マウスと既に準備されているオートファジー欠損マウス等を用いてmtDNA量および複製・分解の日内変動を解析する。さらに、mtDNAの複製因子の過剰発現を目的としたトランスジェニック （Tg） マウスを作製し、細胞、組織、生体レベルでmtDNA量の概日リズムやその生理学的な意義を明らかにする。また作製したTg・KOマウスは系統保存の目的で凍結胚・精子として適宜保存する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症拡大に伴う対応により、本研究以外の業務の対応が逼迫したために時間的猶予がなく、本年度実施予定だった時計遺伝子欠損マウスの作製等の実験計画に遅れが発生したため。これにより関連試薬・消耗品に変更があり、次年度使用額が生じた。次年度使用額と翌年度分として請求した助成金を合わせて使用し、次年度研究実施計画に基づき研究を実施する。