ミトコンドリアDNA量制御の時間生物学モデルの開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16033
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 山口 碧 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術支援センター, 基盤技術研究職員 (20593643)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ミトコンドリアDNA / ミトコンドリアDNA量 / マウス / CRISPR/Cas9

Outline of Annual Research Achievements

これまでに研究代表者は、経時的に採取したマウスの特定組織においてミトコンドリアDNA (mtDNA) の量およびmtDNAの複製に関わる遺伝子の発現が時間依存的に変化していること、また、組織によってその日内変動に差があることを分子生物学的解析により明らかにし、mtDNA量が分子時計による支配を受けていることが示唆された。そこでmtDNAの量の概日的制御機構に着目し、CRISPR/Cas9システムを用いた時計遺伝子欠損マウスの作製を試みた。昨年度に引き続き、十分な切断効率を有するguide RNA (gRNA) を選定し、Cas9ヌクレアーゼとgRNA複合体 (RNP) をエレクトロポレーション法にてマウス前核期受精卵に導入した後、二細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植した。得られた産仔について、PCRとシークエンス解析により標的遺伝子の編集成否の確認を行った結果、変異個体が全く得られなかった。次に、標的を再設計し、人工合成した複数種類のgRNAおよびCas9タンパクをRNPとしてマウス前核期受精卵にエレクトロポレーションにより導入した。体外培養によって胚盤胞期胚まで発生させた後、PCRおよびシークエンス解析にて十分な切断効率を有するgRNAを選定した。続いて、同様の手順によりRNP導入後の2細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植したが、全く産仔を得ることができなかった。現在、標的配列の再設計を行い、引き続きKOマウスおよびコンディショナルKOマウスの作製を計画している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究課題の実施により、時計遺伝子のノックアウト (KO) マウスの作製を試みているが、胚盤胞期胚を用いた事前の切断効率の解析では効率良くゲノム編集が起きていたものの、変異マウス作製に難航しており、分子生物学的解析が当初の計画よりやや遅れていると判断した。早急に研究計画の再検討を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

研究実施計画に基づき、時計遺伝子欠損マウスの作製および解析を実施する。また作製したKOマウスは系統保存の目的で凍結胚・精子として適宜保存する。

Causes of Carryover

変異マウスの作製に遅れが生じたため研究期間の延長を申請し、研究費を次年度に使用する予定とした。研究実施計画に基づき、引き続きCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集マウスの作製および解析を行う。このため次年度予算は、実験用マウスおよび関連試薬、消耗品等の購入費用、外部機関へのシークエンス解析委託費用等に使用する計画とした。