栄養環境刺激がメダカの精子および次世代初期胚へもたらすエピゲノム変化の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16036
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 井上 雄介 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (50814448)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 高脂肪食 / 次世代

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、環境刺激によりもたらされる影響がどのように次世代に伝達されるかという問題に対し、生殖細胞に生じた変化と次世代個体の表現型との連関に着目して研究を行う。具体的には、ゲノム科学の優れたモデル生物であるメダカを用い、親個体に対する高脂肪食投与が生殖細胞および次世代個体にどのような変化をもたらすかを明らかにすることを目指す。
当初は父親個体の高脂肪食摂取が次世代個体にもたらす影響を記載し、精子および初期胚のエピゲノム変化と相関が見られるか検証する予定であった。しかし、次世代個体(胞胚期・成体肝臓)のRNA-seqの結果、父親個体の食餌条件による遺伝子発現の差は検出されなかった。したがってメダカにおいては父親個体に対する高脂肪食投与は次世代個体の形質にほとんど影響を与えないことが示唆されたため、より強い形質変化の誘発が期待される、母親への高脂肪食投与に実験系を切り替えることとした。
まず母親に対する高脂肪食投与が次世代個体にどのような形質変化をもたらすかを確認するために、次世代個体の発生過程を観察した。すると母親高脂肪食投与群ではコントロール群と比較して受精率および正常発生率が低下すること、また尾が曲がるという特徴的な形態変化が生じることが分かった。胞胚期のRNA-seqを行ったところ、母親高脂肪食投与群では1103個および1218個の遺伝子発現上昇および低下がみられた(DESeq2, Padj < 0.1)。DAVIDをもちいたエンリッチメント解析の結果、発現低下した遺伝子にはリボソームタンパク質遺伝子群や発生・ミトコンドリアに関する遺伝子群が多く含まれていたため、これらの遺伝子発現変化が正常発生率の低下に寄与していることが予想された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

父親個体に対する高脂肪食投与で次世代個体に明瞭な表現型変化が誘発されない原因として、昨年度は高脂肪食投与後の親個体の表現型が均一でない可能性を挙げていた。そこで本年度は親個体の飼育条件を個飼い・恒温というより厳密な条件に変更したうえで再度検討を行ったが、それでも高脂肪食投与群とコントロール群の間で次世代個体の表現型に差が見出されなかった。父親高脂肪食投与による次世代個体の表現型変化の評価に時間を要したうえ、期待に反する結果が生じ、研究の方向転換を強いられた点が進捗の遅れにつながった。また、新型コロナウイルスの蔓延による緊急事態宣言発令により、一時的に大学での研究活動に対する制約が課されたことも、遅れの要因となった。

Strategy for Future Research Activity

咋年度の研究より、母親に対する高脂肪食投与により次世代個体の正常発生率が低下することを見出した。メダカは卵生であるため、この正常発生率の低下は卵成分の変化に起因することが予想される。そこで本年度は、正常発生率の低下に寄与する卵成分の同定を試みる。具体的には以下の２点に主に着目する。
1. 母性RNAの変化：胞胚期のRNA-seqにより、母親高脂肪食投与群ではコントロール群と比較してリボソームタンパク質遺伝子の発現が低下していることを見出している。この発現低下は母性RNAに生じた変化を反映していると予想されるが、胞胚のRNAには胚性遺伝子活性化後に発現したRNAも含まれるため、まずは未受精卵のRNA-seqを行うことでリボソームタンパク質遺伝子の発現低下が本当に母性RNAに生じた変化であるかを確認する。また、リボソームタンパク質遺伝子の発現低下の結果としてタンパク質翻訳量の低下が生じているかを確認するために、ピューロマイシンを用いたタンパク質生合成の定量を試みる。さらに翻訳阻害剤処理やリボソームタンパク質遺伝子のノックダウンにより翻訳を阻害した場合に、母親高脂肪食投与で生じた形態異常(尾曲がり)に似た表現型変化が生じるか確認する。
2. 卵黄成分の変化：母親高脂肪食投与群ではコントロール群と比較して卵の色が薄くなることを見出している。したがって、高脂肪食投与により卵黄成分に変化が生じ、これが次世代個体の初期発生に影響を与えている可能性も考えられる。そこで、卵黄成分のメタボローム解析を行い、高脂肪食投与により変化する代謝物を同定する。母親高脂肪食投与群で増加した卵黄成分についてはコントロール群の受精卵へのインジェクションで形質変化がミミックされるか、減少した卵黄成分については処理群の受精卵へのインジェクションで発生異常がレスキューされるか調べる。

Causes of Carryover

当初は父親個体に対する高脂肪食投与が精子および次世代個体のエピゲノムに与える影響を解析する予定であったため、ChIP-seqのライブラリ作成およびシークエンス解析に要する費用を予算に計上していたが、期待に反して表現型変化が観測されなかったため、ChIP-seqを中止することとし、それに伴い次年度使用額が生じた。
本費用は未受精卵のmRNA-seq、卵黄成分のメタボローム解析の試薬の購入に充てる予定である。