2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞由来の成熟化心室筋・心房筋細胞の作製とそのメカニズム解析
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19K16041
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小圷 美聡 京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (90565813)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヒトiPS細胞由来心筋細胞 / 成熟化 / レポーターiPS細胞株 / 化合物スクリーニング / 心室筋細胞 / 心房筋細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトiPS細胞由来心筋細胞の成熟化、及びそのメカニズムを明らかにするために、初年度では心筋細胞への分化と成熟化の指標となるそれぞれ二つの遺伝子に異なる蛍光レポーターを組み込んだiPS細胞株を樹立し、樹立した細胞株由来心筋細胞を用いて成熟化を促進する化合物のスクリーニングを実施した。具体的には、これまでに樹立したヒトiPS（TNNI1-EmGFP）細胞にゲノム編集技術を用いて、成熟化の指標として新たに着目した遺伝子Aの遺伝子座にレポーターを組み込んだTNNI1-EmGFP/A-mCherry細胞株を樹立した。遺伝子Aは、iPS細胞由来心筋細胞およびヒト胎生期心組織では発現が低いものの、ヒト成人心組織で高発現していることを明らかにしており、成人の組織と同等レベルの成熟化を評価できるレポーター細胞株を樹立することができたと考えている。更に、我々はこの細胞株から分化誘導した心室筋細胞に対する成熟化化合物スクリーニングを実施し、遺伝子Aの発現を亢進させるいくつかの候補化合物を見出した。
一方、心房筋細胞については、成熟化研究に用いる細胞をヒトiPS細胞から効率的に得るための新規手法を見出した。具体的には、既知の分化誘導法を用いて得られた細胞集団のうち、CD151の発現が低い集団に心房筋細胞が濃縮されていることを明らかにした。今後、この手法にて得られた心房筋細胞を用いて、前述の候補化合物の作用有無を検証するなどして心室筋・心房筋細胞の成熟化とそのメカニズムを検証していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
成熟化レポーターiPS細胞株を樹立し、スクリーニングに供する細胞として品質に問題がない事を核型解析、および心筋細胞への分化効率から確認した。分化した心室筋細胞については検討が順調に進んだため、次年度に予定していたスクリーニングまで完了した。心房筋細胞については、ヒトiPS細胞から効率的に心房筋細胞を精製できるマーカー分子を同定するなど、アッセイの準備を整えた。計画を変更したため心房筋細胞の検討が未完了であるが、心室筋細胞について次年度に予定していた化合物のスクリーニングまで完了したため、進度としては当初の計画通りと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度でヒトiPS細胞由来の心室筋細胞に対する成熟化促進候補化合物を得ることができたので、次年度はこれら候補化合物の検証、及び得られた候補化合物のアノテーションから成熟化メカニズムの同定を進める。
一方、課題として候補化合物を添加した際に遺伝子Aの発現上昇はみられるが、成体組織と比較してまだ発現レベルが十分でない点が挙げられる。この課題解決に向けて、化合物添加に加えて心筋細胞の3D組織化や、物理的な刺激を加えた培養条件の検討も進めていく。
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| Causes of Carryover |
当初、心室筋・心房筋細胞のスクリーニングを並行して行う計画であったが、計画を変更して心室筋細胞のスクリーニングのみ行ったことにより次年度使用額が生じることとなった。次年度使用額については、心室筋スクリーニングにて得られた候補化合物の検証、心房筋細胞に対する化合物の作用検証、さらに、成熟度の更なる向上のために3D培養や物理的な刺激を加えた培養条件の検討に使用する予定である。
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