2020 Fiscal Year Research-status Report
減数分裂期の部位特異的な組換えにおける染色体構造とゲノム・エピゲノム情報の意義
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19K16045
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
今井 裕紀子 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 博士研究員 (00814782)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 減数分裂 / 相同組み換え / ゼブラフィッシュ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、減数分裂期の組換え開始における「ゲノム・エピゲノム情報」と「染色体構造」の役割を明らかにすることである。減数分裂期の組換えはホットスポットにおける部位特異的なDNAの二重鎖切断（DSB：Double Strand Breaks）によってはじまる。いくつかの生物では、ホットスポットに特徴的なDNA配列やエピゲノム修飾などの「ゲノム・エピゲノム情報」が同定されている。
また、ヒトとゼブラフィッシュの精子形成では染色体スケールでホットスポットが見られ、テロメア近傍でDSBが起こりやすい。減数分裂期の染色体は、テロメアを介して核膜に結合しており、ループ状のクロマチンがタンパク性の軸に結合したループ-軸構造をとる。ヒトとゼブラフィッシュの精子形成では、軸構造と相同染色体間の物理的結合であるシナプシスの形成もテロメア近傍から始まることから、これらの「染色体構造」がテロメア近傍でのDSBの誘導に関わる可能性が考えられるが、その役割は明らかになっていない。
本研究では、減数分裂の新規モデルであるゼブラフィッシュを用いて、「染色体構造」の異常が、DSB形成に与える影響を検討する。これまでに、軸構造・シナプシス・核膜-テロメア接着の変異体を同定し、軸構造因子であるSycp2の変異体ではDSBマーカーが見られないのに対し、シナプシスを担うSycp1の変異体ではテロメア近傍指向的なDSB形成が維持されていることを発見した。また、核膜-テロメア接着変異体では、異所的な軸形成が示唆された。現在、野生型と核膜-テロメア接着の変異体において、DSBとヒストン修飾のゲノムワイドマッピングによるホットスポットの「ゲノム・エピゲノム情報」の同定を進めている。これにより、「染色体構造」の変化と「ゲノム・エピゲノム情報」のそれぞれが、部位特異的なDSB形成に与える影響を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 組換えタンパクDmc1のクロマチン免疫沈降シークエンシング（ChIP-seq）によるDSBのゲノムワイドマッピングは、ゼブラフィッシュでは前例がない。2019年度、モルモット抗ゼブラフィッシュDmc1抗体を用いてゼブラフィッシュ精巣における条件検討を行い、Dmc1 ChIPプロトコルを確立した。2020度は、新たにウサギでも抗体を作製し、これらを用いてChIP-seq解析用のサンプル調製を行った。また、Dmc1 ChIP-seqでは、一本鎖DNAをターゲットとした特殊なライブラリー作製が必要である。これについても条件検討を行い、得られたライブラリーを用いて次世代シークエンス解析を行った。
2. ホットスポットのエピゲノム修飾として、進化的に広く保存されたDSB部位のヒストン修飾であるトリメチル化ヒストンH3リジン4（H3K4me3）に着目し、ゼブラフィッシュ精巣と抗H3K4me3抗体を用いたChIP-seq解析を行った。2019度に確立したChIPプロトコルを用いてサンプル調製を行い、次世代シークエンス解析を行った。H3K4me3は、転写活性の高いプロモーターの修飾としても知られているが、マッピングの結果、減数分裂特異的な遺伝子のプロモーター領域などにシグナルが見られた。
3. ゼブラフィッシュ精母細胞における染色体軸の形成はテロメア近傍で始まることから、減数分裂期の核膜-テロメア接着が軸形成に関わる可能性に着目した。これまでに作製した核膜-テロメア接着の変異体２系統のうち、2019度の解析から異所的な軸形成が示唆された変異体の精巣を用いてDmc1 ChIP-seqを行った。
4. 2019年度に解析を行ったSycp2の変異体に加え、2020年度はシナプシスが異常となるSycp1の変異体解析を行い、これらの染色体構造の異常が組換えに与える影響を明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 現在解析を進めている野生型ゼブラフィッシュのDmc1 ChIP-seqの結果から、正常な減数分裂におけるDSB部位をゲノムワイド・配列レベルで同定し、詳細なDSBマップを得る。さらに、H3K4me3 ChIP-seqの結果から、Dmc1 ChIP-seqでマッピングされたDSBホットスポットの近傍にこの修飾が見られるか検討し、野生型ホットスポットにおける「エピゲノム情報」を得る。
2. 核膜-テロメア接着の変異体ゼブラフィッシュのDmc1 ChIP-seqについてもシークエンスデータの解析を進め、DSBマップを作成する。得られたDSBマップを野生型と比較し、その違いを検討する。違いが見られた場合、軸の形成という「染色体構造」がDSB部位を決めると考えられる。変異体でDSBが起こる領域にどのような特徴が見られるか解析する。さらに、核膜-テロメア接着変異体を用いてH3K4me3のChIP-seqを行い、新しいホットスポット近傍にこの修飾が見られるか検討する。また、野生型のH3K4me3マップと比較することで、「染色体構造」が「エピゲノム情報」に影響をあたえるか明らかにする。違いが見られなかった場合、「ゲノム・エピゲノム情報」によってDSBがテロメア近傍に誘導されると考えられる。この場合、マッピングにより得られるDSB部位近傍に共通のDNAモチーフ等が見られるか検討を行う。また、野生型のH3K4me3マップで、テロメア近傍にこの修飾が集中して見られるか検討する。
3. Dmc1 ChIP-seq解析を繰り返し、再現性を確認する。
4. 核膜-テロメア接着の変異体ゼブラフィッシュについて、免疫細胞化学を中心とした表現型の解析を進める。
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| Causes of Carryover |
次世代シークエンス解析費用を節約でき、2020年度の予算に余りが生じたため。来年度のシークエンス解析費用にあてる。
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Research Products
(5 results)
