2020 Fiscal Year Research-status Report

Thermo-sensing Mechanism of Heat Shock Factor 1 through Comparative Biology

Research Project

Project/Area Number	19K16046
Research Institution	National Institute for Basic Biology
Principal Investigator	坂本丞基礎生物学研究所, 生命熱動態研究室, 特任助教 (80804145)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	熱ショック応答 / 熱ショック転写因子1 / メダカ / 比較生物学 / 温度環境応答 / バイオサーモロジー
Outline of Annual Research Achievements	当該研究の目的は熱ショック応答の制御因子の一つとして知られる熱ショック転写因子1（HSF1）の温度依存的な活性化機構を明らかにすることにある。今年度は、前年度から継続して、CRISPR/Cas9法を用いたノックイン法の検討を実施した。これまでに、gRNAの設計や遺伝子導入用のコンストラクトの構築は終了しており、トランスジェニックメダカの作出に着手した。GFP遺伝子のみが発現するようなコンストラクトをノックインすると、GFP陽性のメダカ胚が得られた。そのため、設計したsgRNAを利用したノックインは機能していると判断した。次に、HSF1　CDSの3'端に直接mNeonGreenを連結したコンストラクトを、メダカ胚にマイクロインジェクションした。しかし、このコンストラクトではmNeonGreen陽性メダカ胚は得られなかった。これは、HSF1遺伝子の発現量が低いこと、融合タンパク質にするとHSF1の分解と同時に蛍光タンパク質も分解されてしまうことなどが原因として考えられる。これを回避する方法として2A配列を使用してHSF1とmNeonGreenが分割されるようにすることで、HSF1が分解されてもmNeonGreenが分解されないようにできる。このようなノックイン用のコンストラクトを作成し、現在インジェクションを開始している。加えて、キメラHSF1の機能解析をハイスループットに行うために、メダカ培養細胞を利用した評価系の構築に着手した。使用する細胞株を入手して、現在遺伝子導入方法を検討中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason バイオインフォマティックな解析は現状良好な結果が得られていないものの、内在性HSF1の発現パターンを模倣したトランスジェニックメダカの作出は比較的良好な結果が得られている。また、培養細胞を利用したHSF1機能評価系は当初哺乳類培養細胞を使用する予定であった。しかし、培養温度が37℃であるなど、変温動物のタンパク質を扱うのに適していないと判断しメダカ培養細胞を利用するように方針を転換した。これを利用した評価系も構築しつつある。これらの状況を加味して、昨今の感染症の情勢により実験着手が遅れたものの、「概ね順調に進んでいる」とした。
Strategy for Future Research Activity	バイオインフォマティックな解析は現在まで良好な結果が得られていないことから、ウェットな実験を優先して行う。早急に培養細胞を利用した評価系を確立して温度応答性の解析に取り掛かる。また、トランスジェニックメダカの作出にはある程度の時間を要するため、こちらも並行して進めることとする。熱ショック応答を評価するレポーターコンストラクトは既に所属研究室にあるため、これを使用する。
Causes of Carryover	感染症の拡大状況により年度初頭にテレワークの比率が非常に高くなり、実験の開始が遅れた。そのために、次年度使用額が生じた。繰越分は2021年度の物品購入費に主に充当する予定である。