Thermo-sensing Mechanism of Heat Shock Factor 1 through Comparative Biology

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K16046
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 坂本 丞 基礎生物学研究所, 生命熱動態研究室, 特任助教 (80804145)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 熱ショック応答 / 熱ショック転写因子 / ゲノム編集 / 温度 / メダカ / 比較生物学

Outline of Annual Research Achievements

当該研究の目的は熱ショック応答の制御因子の一つとして知られる熱ショック転写因子1（HSF1）の温度依存的な活性化機構を明らかにすることにある。そのためには、HSF1の温度特性の違いを解析するためのプラットフォームの構築が必要である。
今年度は、前年度から継続して、CRISPR/Cas9法を用いたノックイン法の検討を実施した。前年度までに設計し機能することが明らかになったノックインメダカ作出用のsgRNAを使用して、トランスジェニックメダカの作出を継続して行った。このsgRNAはメダカHSF1遺伝子の5'-UTRを標的とするもので、ノックイン用のコンストラクトを標的とする領域に挿入することで、メダカ内在性HSF1の発現パターンを模倣することができるようになるものである。HSF1とmNeonGreenのコーディング配列の間に2A配列を挿入し、HSF1の分解等を受けない独立した形でmNeonGreenが蓄積するようなコンストラクトを設計した。しかしながら、このコンストラクトを使用しても蛍光シグナル陽性のメダカ胚は得られなかった。本法ではCas9　mRNAをインジェクションに使用するが、RNaseの影響により導入効率が落ちることがある。そこで、サンプル調整方法を見直した上で、Cas9タンパク質を使用したノックインを行うことで改善の余地がある。
また、メダカ培養細胞を利用したHSF1の温度特性解析系の構築に置いては、細胞の増殖が遅いことやトランスフェクション効率が悪いことが障壁となっている。細胞の増殖が遅いことはメダカ上皮細胞の初代培養である程度の改善が見られ、トランスフェクション効率は電気穿孔法を用いることなどで改善の余地がある。
この他にも、温度特性の違いを解析するための基盤は構築を進めており、今後これらを利用してより詳細な解析を進めていく必要がある。