HP1による染色体パッセンジャー複合体の空間的活性制御機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16047
• Research Institution: Japanese Foundation for Cancer Research
• Principal Investigator: 迫 洸佑 公益財団法人がん研究会, がん研究所 実験病理部, 研究員 (00838469)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 染色体分配 / Aurora B / INCENP / HP1 / 天然変性領域 / 構造解析 / キネトコア

Outline of Annual Research Achievements

分裂期キナーゼのAurora Bを含む染色体パッセンジャー複合体(CPC)は、染色体分配時においてセントロメアに局在し、その『局在範囲外』の動原体タンパク群のリン酸化を行うことで、動原体/微小管の結合異常の補正機能を担っているが、なぜ局在範囲外まで活性が届くのか、その分子背景は未だに不明である。
我々は先行研究で、CPCの活性制御におけるHP1結合の必要性を見出していた。HP1はCPCの足場タンパク質であるINCENPの天然変性領域(IDR)中のPxVxL/I-motif (以下PVI)に結合するため、我々は「HP1結合時にIDR全長が状態変化し、CPCの活性到達範囲を広げる」という作業仮説を立てた。加えて、本研究課題の前実験(NMR解析)から、HP1/INCENP結合は、これまで報告されてきたHP1の典型的な結合様式(PVIのみを介した結合)ではなく、PVIの下流領域(2nd-site)も使用する結合様式であることを明らかにしていた。
昨年度は、PVIと2nd-siteがどちらも細胞内でCPCの活性維持に必要な領域であることを明らかにした。加えて、Aurora B-INCENPヘテロ二量体を用いてHS-AFM解析を実施し、HP1が結合した際、INCENPがIDR全長で伸張/屈伸反応を起こすことを突き止めた。
本年度は、HP1結合時にPVIと2nd-siteがそれぞれ構造変化することをNMR解析でさらに明らかにした。この二連結合様式の生理的意義を探るべく、INCNEPと同じく分裂期のセントロメアに局在するSgo1(PVIのみ保有)に対し、INCENPのPVI+2nd-siteを導入した。すると、HP1がセントロメアに過剰局在したことから、この二連結合様式は分裂期においてINCENPが他のHP1結合タンパクよりも強くHP1と結合するために必要であることが分かった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

INCENPのPVI周辺構造の二次元構造予測を行うと、PVIがbeta-sheet構造を、その5アミノ酸残基ほど下流の領域(2nd-site)がalpha-helix構造をとるという予測が出ていた。本年度は、液中でのHP1結合時において、PVIと2nd-siteが天然変性状態からそれぞれ構造変化を起こし、予測通りの構造をとることをNMR解析で明らかにした。加えて、二次元構造予測によって他のHP1結合タンパクとINCENPのPVI周辺配列を比較した際、2nd-siteのalpha-helix構造予測はINCENP特有であった。過去の報告から、HP1は分裂期のセントロメア局在をINCENPに依存している一方で、INCENPと同様にセントロメア局在をしているSgo1(PVIのみ保有)とはほとんど相互作用しない可能性が示唆されていた。よって、INCENPの二連結合様式がこの差を生み出す鍵になっているのではないかと考え、分裂期における役割を検証することにした。まず、Sgo1のPVIをINCENPのPVI+2nd-site (33アミノ酸残基)に置換したキメラ変異体を作製し培養細胞に発現させたところ、免疫染色によってHP1のセントロメア過剰局在が確認された。加えて、INCENPのPVI+2nd-siteの代わりにSgo1のPVI周辺配列(上記に対応する33アミノ酸残基)を置換したキメラ変異体は、免疫沈降においてHP1の結合が低下した。これらの実験結果から、INCENP特有の二連結合様式は分裂期においてINCENPが他のHP1結合タンパクよりも強くHP1と結合するために必要である可能性が示唆された。
これらの結果は本研究をさらに発展させる内容となったことから、予想以上に研究が進展したと判断した。

Strategy for Future Research Activity

分裂期のHP1のセントロメア局在の意義については諸説あり、INCENP以外のPVI保有タンパク質に焦点を当てた知見は複数報告されているものの、INCENPとの相互作用を中心にした研究報告をしているのは本研究遂行者の所属研究室のみである。このことから、今後(研究計画の第三年度)は、今回発見したHP1/INCENPの二連結合様式とその生理的意義について論文を執筆/投稿しつつ、分裂期におけるHP1/INCENP相互作用の重要性を学会などで改めて問うことに重きを置いた研究活動を遂行する予定である。
加えて、昨年度にHS-AFM解析で見られたINCENPの伸長反応が細胞内のCPC活性制御に必要な分子機構であるかどうかを検証するため、引き続き培養細胞の実験系の構築と解析を進める予定である。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症の拡大に伴い、本年度の物品納品時期に遅れが発生し、結果として次年度使用額が生じた。本年度に物品の納品がされ次第、繰越金額を精算する予定である。