2020 Fiscal Year Research-status Report
Cdk-サイクリンによるG1/Sチェックポイントの閾値決定機構の解明
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19K16050
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
後藤 祐平 基礎生物学研究所, 定量生物学研究部門, 助教 (50814620)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 細胞周期 / CDK / サイクリン / 分裂酵母 / 蛍光相関分光法 / 微小流路 / ノックイン / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞周期とその制御は、すべての真核生物にとって必須の生命現象であり、その破綻は細胞死や細胞のがん化の原因となる。外界からの刺激や内在性のストレスにより細胞周期の進行を不可逆的に制御する細胞周期チェックポイントが細胞周期各時期を厳密に制御している。本研究では、G1/S期チェックポイントに着目し、1細胞定量イメージングにより、分裂酵母およびヒト培養細胞を用いて進化的に保存された「CDKCdk-サイクリンによるG1/S期チェックポイントの閾値決定機構の解明」を目的としている。
昨年度までに、細胞周期マスター制御因子であるCDK-サイクリンを可視化するために、分裂酵母の内在性CDK-サイクリンに蛍光タンパク質ｍNeonGreenおよびｍCherry2をタグ付けした株を樹立し各種生化学パラメータをイメージングによりを測定することに成功していた。今年度はそれに加えて、CDKのリン酸化酵素活性を生体内でリアルタイムに測定できるCDK-FRETセンサーを新規開発、改良し、CDK-サイクリンの量や結合だけでなく最終的なアウトプットとなる活性を測定する系も完成した。
今後は、活性も含めたCDK-サイクリンの生化学パラメーターが細胞周期中でどのように変化するのか、また、DNAダメージや栄養源枯渇などによる細胞周期制御、またそれらへの適応の仮定でパラメータどのように変動するのかを測定する。
ヒト培養細胞における細胞周期制御因子のノックイン株樹立は苦戦しており、タンパク質そのものではなく、その活性のアウトプットとなる現象をとらえるバイオセンサーによりパラメータ測定を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の進捗に加えて、CDKのリン酸化活性を直接測定できるFRETバイオセンサーを開発できた。これにより、サイクリンの量的変動から、最終的なリン酸化活性のアウトプットまでをシングルセルで経時的に観察することが可能となった。光遺伝学による細胞周期制御も新たなツールを開発しており、観察と摂動を高度に組み合わせて細胞周期の作動原理に迫りたい。
ヒト培養細胞ノックインについては苦戦し方針を転換している。
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| Strategy for Future Research Activity |
分裂酵母については、これまでに作成したノックイン株とFRETバイオセンサーを用いて細胞周期制御因子の濃度、解離定数、活性などを細胞周期を通じて経時的に1細胞レベルで測定する。また、DNAダメージや栄養源枯渇などによる一時的な細胞周期停止、また、それらへの適応から細胞周期再開する際の制御にそれらがどのように変動するのかを測定する。測定したパラメータを用いて、外界からの情報がどのようにして細胞周期運命決定へと変換されるのかを数理モデルにより解き明かしたい。また、その数理モデルから得られた知見を、遺伝子ノックアウトや変異体、また、光遺伝学による細胞周期操作等の細胞内機能操作によって因果関係を確定させる。
ヒト培養細胞は、細胞周期制御因子の活性を測るバイオセンサーを導入し、チェックポイント機構の分子メカニズムに迫る。
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| Causes of Carryover |
当該年度は新型コロナウイルス感染症予防のため、国内および国際学会への現地参加ができなかったこと、共同研究先との打ち合わせ等をオンラインで行ったことなどから旅費がかからなかった。また、論文投稿も次年度に行うこととしたため、次年度使用額が生じた。
次年度末から学会の現地参加が可能になることを見越して、学会参加のための旅費、また、論文投稿にかかわる費用と追加実験の消耗品などに使用する予定である。
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