2019 Fiscal Year Research-status Report
Molecular basis for lipid presenting molecule CD1d
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19K16051
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
喜多 俊介 北海道大学, 薬学研究院, 特任助教 (10702003)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CD1 / 表面プラズモン共鳴 / X線結晶構造解析 / Saposin / TCR / 示差走査熱量測定 / NKT細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，CD1dによる抗原提示とNatural killer T（NKT）細胞の活性化というイベントを中心として， そこから時間的，空間的に隣接して起こるCD1dへの脂質積載や免疫制御分子との関係性も含めて， CD1dの分子基盤を構築することを目的としている．具体的研究内容として、テーマ①アミド型αGalCerによるCD1dを介したNKT細胞活性化機構の解明、テーマ②CD1dと相互作用する分子群との複合体構造解析、テーマ③CD1dが認識する昆虫由来脂質成分の解析に取り組んでいる．
今年度は、テーマ①については、CD1dを認識するNKT細胞のT細胞受容体（TCR）をサブクローニングし、大腸菌で不溶性画分に発現させ、希釈法で巻き戻すことに成功した。また、CD1d-αGalCer複合体とCD1d-αGalCer amide複合体との熱安定性を示差走査熱量測定（DSC）で測定した。テーマ②については、CD1dへの脂質積載を担うヒトSaposin A, B, C, Dの４種類をそれぞれサブクローニングし、大腸菌から調製した。調製したSaposinについて、界面活性剤との複合体を形成する条件をゲルろ過クロマトグラフィーを用いて検討した。また、新たにCD1bについての研究を開始し、CD1dと同様にカイコ発現系で調製に成功した。CD1bについてもSaposinによる脂質積載機構を明らかにしていく予定である。テーマ③については、カイコで発現させたCD1bからカイコの内在性脂質を抽出し、TLCで展開して標準脂質と比較した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の遂行に必要なNKT細胞のTCRやSaposin A-Dの調製に成功した。研究材料が揃ったため、タンパク質間相互作用解析に着手している。Saposin A-Dについては、界面活性剤との複合体形成条件を検討し、幾つかの有効な組み合わせを見出した。また、新たに研究を始めたCD1bについても発現系を確立し、結晶化スクリーニングや脂質の解析を進めた。CD1dと抗原複合体の熱安定性についても解析に成功し、アミド基の有無による著しい差を認めた。以上のことから、本研究は概ね順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
テーマ①アミド型αGalCerによるCD1dを介したNKT細胞活性化機構の解明については、CD1d-αGalCer amide複合体とTCRの相互作用解析を行い、CD1d-αGalCerの場合と比較する。相互作用解析には表面プラズモン共鳴（SPR）を用いる予定であり、既に固定化方法などは確立済みである。相互作用解析の結果、CD1d-αGalCerとCD1d-αGalCer amideに有意な違いが見られた場合は、CD1d-αGalCer amide複合体のX線結晶構造解析を行う。テーマ②CD1dと相互作用する分子群との複合体構造解析については、Saposin-脂質/界面活性剤複合体とCD1d/CD1bとの相互作用解析を行う。既にSaposin-界面活性剤の形成条件については検討を済ませたので、脂質についても同様に条件検討を進める。安定な複合体が得られれば速やかにSPRによる相互作用解析を行う。また、免疫制御分子（LILRB2）とCD１bとの相互作用解析についてもSPRを用いて行う予定である。テーマ③CD1dが認識する昆虫由来脂質成分の解析については、CD1d、CD1bから抽出したカイコ内在性脂質について、LC-MSを用いて詳細に解析する。
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