2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒトTUT1によるRNAポリウリジル化の分子構造基盤
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19K16053
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山下 征輔 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 助教 (30769576)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヌクレオチド転移酵素 / U6 snRNA / TUT1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TUT1はU6 snRNAの成熟化を担う酵素であり、U6 snRNAを特異的に認識して3’末端にウリジンを付加する活性を持つ。U6 snRNAの3’末端はU6 snRNPの形成やスプライソソームのリサイクルに関わるため、その成熟化は真核生物の遺伝子発現に重要なプロセスである。
申請者らは本研究に先だってTUT1単体の立体構造の決定に成功し、生化学的な解析と合わ
せてTUT1によるU6 snRNAに特異的なウリジル化反応の概要を明らかにしてきた。しかし複合体の立体構造は明らかになっておらず、完全な結合様式の解明には至っていない。本研究の目的は、これまでの申請者らの成果を発展させてTUT1とU6 snRNAの複合体立体構造解析を行い、その特異的な認識メカニズムを原子分解能で明らかにすることである。
本年度はTUT1とU6 snRNAの複合体結晶化に向けて研究を行った。複合体の結晶化には、安定でフレキシブルな領域の少ない複合体試料の調製が肝要である。そこでまずTUT1とU6 snRNAのそれぞれについて各種変異体を用いた生化学解析を行い、TUT1によるウリジル化活性に必要な領域の同定および、オリゴウリジル化の詳細な生化学的性質の解明を進めた。得られた知見をもとに各種コンストラクトの最適化を進めるとともに、様々なタンパク質、RNAコンストラクトの大量調製・複合体結晶化スクリーニングに取り組んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでにタンパク質およびRNAコンストラクトについて様々な変異体を用いて生化学解析を行い、タンパク側およびRNA側の双方のどの領域が高い親和性や反応効率に重要であるかを明らかにすることができた。得られた知見をもとに結晶化コンストラクトの最適化を進めるとともに、順次結晶化スクリーニングを進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も引き続き、これまでに得られた生化学的知見をもとにコンストラクトの最適化を進めるとともに、さらなる結晶化スクリーニングを行って複合体結晶を作成する。得られた結晶を用いてX線結晶構造解析を行い、複合体構造からTUT1によるU6 snRNAの認識メカニズムを解明する。結晶の作成が困難であるような場合には、X線小角散乱や電子顕微鏡など他の手法の利用も検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額は少額の端数によるものであり、翌年度分はもともとの計画に基づいて経費を使用する。
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