2020 Fiscal Year Research-status Report
膵臓がんの検出・抑制に向けた, 膵酵素とがん特異糖鎖との相互作用解析
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19K16072
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| Research Institution | Ochanomizu University |
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Principal Investigator |
伊達 公恵 お茶の水女子大学, ヒューマンライフイノベーション研究所, 特任講師 (90709180)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 膵臓がん / 糖鎖 / 膵臓酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵臓がんは、早期発見や治療が極めて難しく、有用な感度と特異性を備える検出方法と抗がん剤の開発が強く求められている。本研究では、膵腺がんの検出と抑制に向けて、膵酵素と膵腺がんマーカー糖鎖との相互作用を解明することを目的としている。膵腺がんでは、H type1/3糖鎖の発現上昇や特定タンパク質のフコース付加が報告されており、膵腺がんの糖鎖マーカーとなっている。本研究において、膵酵素のα-アミラーゼやトリプシンが、基質とは異なる、各々特定の糖や糖鎖に結合する「糖結合性」をもつことに注目し、これら膵酵素のいずれかが膵腺がんのマーカー糖鎖に特異的に結合し、膵腺がんを抑制するとの仮説を立てた。この仮説の実証研究として、膵酵素と膵腺がんマーカー糖鎖との相互作用を解明し、膵腺がんの検出と抑制へと繋げることが目標である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２年目は、膵臓がんマーカー糖鎖であるH type1/3及び糖タンパク質フコシル化に共通する「フコース」に焦点を絞り、フコースに特異的に結合する膵酵素を同定し、フコースの栄養消化への影響を明らかにした。コロナ禍への対応として、２年目に予定していたヒト膵線がん細胞を用いた実験を、使用経験のあるヒト上皮がん細胞を用いた予備検討に変更した。また、３年目のフコースの栄養消化への影響を前倒して行った。
膵酵素のフコースへの結合性は、主にビオチン化等ポリマープローブを用いたELISAによって明らかにした。中性条件下において、他の糖よりもフコースに強い結合性を示したのは、リボヌクレアーゼAとトリプシンノーゲンだった。α-アミラーゼとリパーゼ、エラスターゼはマンノースに強く結合した。デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼBは、どの糖に対しても特異的な結合を示さなかった。次に、膵酵素の各活性評価系を立ちあげ、フコースの栄養消化への影響を調べた。α-アミラーゼによる糖質分解、リパーゼによる脂質分解、トリプシン・キモトリプシン・エラスターゼによる各タンパク質分解、デオキシリボヌクレアーゼ活性、リボヌクレアーゼ活性、これら全てにおいてフコースの影響は検出されなかった。唯一、トリプシンノーゲンからトリプシンの自己活性化において、フコースの阻害作用が示された。
ヒト癌細胞への増殖抑制実験にも着手した。フコースに結合を示さないα-アミラーゼの添加によって、ヒト癌細胞の増殖が促進されることが判明した。一方、上記結合試験によって、フコースに対して結合特異性を示したリボヌクレアーゼAとトリプシンノーゲンは、ヒト癌細胞の増殖を抑制する傾向が観察された。
以上より、リボヌクレアーゼAとトリプシンノーゲンは、膵臓がんマーカー糖鎖に特徴的なフコースに特異的に結合し、ヒト癌細胞を抑制する膵酵素であることが実証された。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、使用経験のあるヒト上皮がん細胞による増殖抑制評価を行ったが、次年度は、膵腺がん細胞を用いて膵酵素の膵腺がんへの影響を明らかにする。
１） 膵腺がん細胞の培養および評価系を立ち上げ
２） 膵酵素の抗がん作用：「増殖」「浸潤」「遊走」についてタイムラプス撮影による経時変化観察
３） 膵腺がん細胞への結合およびエンドサイトーシス経路を含めた局在解析：AlexaFlour488標識膵酵素を調製しイメージング解析を行う
４） がんの悪性度や転移に深く関わる (1)サイトカイン（CD44）, (2)上皮・間葉転換関連分子（E, N-カドヘリン, Vimentin, Slug）, (3)アポトーシス誘導について、リアルタイムPCRでのmRNA定量と、蛍光標識アネキシンVを用いたフローサイトメトリー解析
これらの４つの解析から、膵酵素の抗膵線がんの評価と、その作用のメカニズム解明を行う。
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| Causes of Carryover |
【次年度使用額が生じた理由】コロナ禍への対応として、２年目（本年度）に予定していたヒト膵線がん細胞を用いた実験を、使用経験のあるヒト上皮がん細胞を用いた予備検討に変更した。つまり、ヒト膵線がん細胞の購入を３年度目（次年度）に見送ったため、次年度使用額が生じた。
【使用計画】3年度目にヒト膵線がん細胞の購入費用に当てる
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