2020 Fiscal Year Research-status Report
Molecular Mechanisms of recognition of G-quadruplex by Rif1, a conserved nuclear factor regulating chromatin architecture
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19K16082
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
覺正 直子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (30599593)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | グアニン４重鎖DNA / Rif1タンパク質 / クロマチンループ / 高次構造 / 複製タイミング / RNA-DNAハイブリッド / 分裂酵母 / 多量体形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1) C端にはG4結合ドメインと、多量体化ドメインの両者が存在する。G4結合のみ、あるいは多量体化のみに必要な変異体を発見するため、分裂酵母Rif1にMn-PCRによるランダム変異導入を行い、スクリーニングした結果、G4結合、あるいは多量体化能のみを欠損した変異体を同定した(I1373M,および Q1392P)。 2) 得られた変異を全長Rif1に導入し、hsk1ts株の相補能を検証した結果、両者とも部分的な相補能を有することが明らかとなり、Rif1のG4結合、多量体化能の両者がその複製抑制に必要であることが明らかとなった。 3) 分裂酵母のRif1の多量体化にはC末44aaで十分であることを見出した。さらに、この領域はcoiled-coil構造を形成し４量体を形成することがSEC-MALS (size-exclusion chromatography coupled with multi-angle light scattering)解析 により明らかとなった。 4) 分裂酵母および動物細胞のRif1（全長、N端、C端ドメイン）タンパク質を大量に調製・精製した。C端ドメインについてはX線構造解析を行い、全長はクライオ電顕による、観察を行なっている。 5)より分解の少ない全長Rif1を取得するため、S.japonicusのRif1(1296aa)の増産、また分解の少ない分裂酵母変異型Rif1を作成した。 6)新たに作成したN端に、変異を有する分裂酵母変異型Rif1を作成し精製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
分裂酵母Rif1のG4結合能あるいは多量体化能を選択的に喪失する変異体を獲得でき、それらの機能解析を行なった。またC末ドメインの構造の概要が明らかにすることができた。全長Rif1のクライオ電顕による解析は、Rif1全長タンパク質などのnegative stainingで形態について、情報を得ることはできたが、精製画分の性状のため、クライオ電顕において十分な解析像を得ることができなかった。また、その後の精製で分解産物、収量の問題が発生し、構造解析に遅れが生じた。さらに、構造解析は海外の研究者と共同で行なっているがコロナ禍のため、訪問などができず、一部計画通りには進まなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) 分裂酵母の改変型全長タンパク質は分解を免れているので、大量精製する。また動物細胞の全長Rif1あるいは、NCポリペプチド（中央部のIDPを欠損している）の大量精製に、細胞株、transfection方法などを変えて再挑戦する。精製できたら、タンパク質単独およびG4との複合体の構造のクライオ電顕解析を進める。
2) 分裂酵母および動物細胞のRif1C端ドメインは大量調製を行うことができたので、結晶化を進めX線構造解析を行う。
3) 精製した全長Rif1タンパク質とRif1結合部位由来のG4の相互作用を、各種G4リガンドの存在下、非存在下で、ヌクレアーゼフットプリントなどにより詳細に解析する。G4構造としては、同一配列であるが、一本鎖上に形成されるG4、二本鎖DNAを熱処理して形成されるG4、転写により形成されるG4を用い、その構造、および相互作用の様式を比較する。
4) Phenyldiazirin photo-cross-linkerを用いてG4 DNA上のRif1タンパク質相互作用部位を決定する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍で、実験遂行に大きな障害が出て、大量精製のための実験を予定通り遂行できなかったため、未使用が生じた。
次年度で、タンパク質大量精製のために必要な血清、培地、タンパク精製のためのレジンなどの購入に充てる。
また、結晶化の条件を決定するためのキットの購入をおこなう。
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