2021 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular Mechanisms of recognition of G-quadruplex by Rif1, a conserved nuclear factor regulating chromatin architecture
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19K16082
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
覺正 直子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (30599593)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | グアニン４重鎖DNA / Rif1タンパク質 / クロマチンループ / 高次構造 / 複製タイミング / RNA-DNAハイブリッド / 分裂酵母 / 多量体形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
進化的に保存された核タンパク質Rif1は、クロマチン結合を介して、結合部位近傍100kbにわたりDNA複製開始を抑制する。生化学的解析からRif1はグアニン4重鎖(G4)構造に特異的に結合すること、その結合によりクロマチンファイバーを寄せ集め特異的なクロマチンドメインを形成する可能性を指摘した。これまでの研究から、Rif1はN端とC端にそれぞれG4結合ドメインを有し、C端は8-16量体の多量体を形成する。本研究では、Rif1が２つのDNA結合ドメインを介してG4に結合し、染色体を束ねてクロマチン高次ドメインを形成するメカニズムを、その高次構造の解析を通じて解明する。昨年度までの成果から、C末に存在するG4結合と、多量体形成能はそれぞれRif1の複製抑制機能に重要であることが示された。又、C末領域は反平行のcoiled-coil構造形成を介して4量体あるいはさらに大きな多量体を形成することが明らかとなった。
今年度、分裂酵母C末272aa, 91aa, 64aa, 44aaについてクロスリンクにより多量体状態を解析した。その結果、44aaでは２量体がメインであったが91aa, 272aaでは4量体がそれぞれ70%, 90%をしめた。又、native agarose gelを用いた新規G4-タンパク質複合体測定系を開発した。それにより、C末91aaもG4と特異的に相互作用すること、さらに短いC末64, 44aaのポリペプチドも、この測定系でG4と相互作用したが、G4を作らない１本鎖DNAとも相互作用することから特異性を喪失していることが示唆された。又、多量体形成能を喪失した変異体を複数単離し、それらの挙動から、二量体を形成するもの(mut11, mut37)、単量体を主に形成するもの(nut40)、多量体形成能は維持しているがG4結合能が減弱するもの(mut9)が単離された。
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