2020 Fiscal Year Research-status Report
SunTag法によるヒストン編集を利用した脂肪分化制御技術の開発
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19K16100
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
鈴木 智大 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (00804775)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | SunTag法 / SETDB1 / 脂肪細胞分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度の計画では，「方法1-3:ヒストン編集を実現できるメチル化関連酵素の絞り込み」により脂肪細胞分化を制御する可能性のあるメチル化関連酵素をqPCRとChIP-seqによってスクリーニングし，「方法2-1:Cebpa/Pparg遺伝子のヒストン編集の脂肪細胞分化への必要性検証」を行うこととしていた。
以上の申請内容について，作製したSunTag因子 (dCas9-5xGCN4，scFv-メチル化関連酵素, gRNA) 発現細胞に対して，Cebpa/Pparg遺伝子発現の検証 (方法1-3) とOil Red O染色による分化の評価 (方法2-1)を行った。その結果，16個のいずれのヒストンメチル化関連酵素 (LSD1，PHF2，JMJD1C，JMJD2A，JMJD2B，JMJD6，SETDB1, JMJD1A，PHF8，PRMT1，PRMT5，PRMT7，JMJD3，JMJD2D，SETD7，または, SMYD3) を用いても脂肪細胞分化への影響が確認できなかった。
そこで，dCas9-5xGCN4のGCN4抗原の数が少ないく動員される酵素の数が少ないことが原因ではないかと考え，dCas9-10xGCN4を発現する細胞株を作製した。この細胞株にGCN4抗原を認識するscFvとヒストンメチル化酵素SETDB1の融合タンパク質 (scFv-SETDB1) とCebpaを標的とするgRNAを発現させたところ，脂肪細胞分化を抑制することに成功した。この脂肪細胞分化の抑制は，SETDB1によるH3K9me3修飾によるCebpa遺伝子の抑制が原因であると考えられる。現在，ChIPシステムを確立を完了し，ChIP-qPCRにより検証中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
方法1-3 「ヒストン編集を実現できるメチル化関連酵素の絞り込み」に関しては，当初作製したdCas9-5xGCN4発現細胞に対してscFv-メチル化関連酵素(16種類のいずれか)およびgRNAを発現させても脂肪細胞分化の制御を行うことができなかった。しかしながら，この問題点はdCas9-10xGCN4を用いることで克服することができた。すなわち，作製したdCas9-10xGCN4安定発現細胞において，H3K9me3ヒストンメチル化関連酵素の一つであるSETDB1とCebpaに対するgRNAを安定発現させることで，Cebpa／Pparg遺伝子の発現を抑制することに成功した。ChIP-seqによる検証に関しては少し遅延気味ではあるが，昨年度中にChIPシステムを確立済みであり，今年度中にChIP-qPCRおよびChIP-seqを行う予定である。本項目については，予定の80%程度の進度であると考えている。
方法2-1 「Cebpa/Pparg遺伝子のヒストン編集の脂肪細胞分化への必要性検証」については，Oil Red O染色による終末分化の検証を既に完了している。全項目と同様，本項目においてもSETDB1の動員によって脂肪細胞の終末分化を抑制することが明らかになっている。SETDB1の酵素不活性型 (K867R) プラスミドに関しては既に作製済みであり，2021年度はSETDB1 (K867R) 安定発現株を用いて脂肪細胞分化抑制に対するSETDB1の酵素活性の影響を評価予定である。本項目に関しては予定通りの進度であると考えられる。
以上により，本年度の本研究の進捗状況は「おおむね予定通りである」と考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度はまず，ChIP-qPCRおよびChIP-seqを行うことでSunTag因子が標的領域にリクルートされていることを検証し，【目的1】 「SunTag法によるメチル化関連酵素を介した特定ゲノム領域のヒストン編集技術の確立」を達成する。
また，酵素不活性型SETDB1 (K867R) 安定発現株を利用してOil Red O染色とqPCRを行うことで，方法2-1 「Cebpa/Pparg遺伝子のヒストン編集の脂肪細胞分化への必要性検証」を実施する。SunTag法では巨大タンパク質が標的領域に動員されるため，Cebpa遺伝子発現の抑制が巨大タンパク質動員ではなく酵素活性によるものであることとを示す上で，本項目は非常に重要な実験となる。
最後に，SunTag因子によってCebpa遺伝子を不活性化した細胞株にCebpa遺伝子を強制発現することで，方法2-2 「Cebpa/Pparg遺伝子のヒストン編集の脂肪細胞分化への十分性検証」を行う。SunTag法は非常に高い特異性を持って遺伝子発現を抑制することが考えられる。したがって，方法1-3のChIP-seqの結果と本項目によって十分性を検証することは，SunTag法の特異性を示す上で不可欠である。
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Research Products
(1 results)
