In vitro睡眠解析系を利用した睡眠制御分子ネットワークの一斉同定

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16115
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 戸根 大輔 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員 (60806610)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 睡眠覚醒サイクル / HTS

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではハイスループットなIn vitro睡眠解析系の構築により、睡眠覚醒制御の分子ネットワークを明らかにすることを目的とする。本年度は系の構築のために、安定に神経活動シグナルをモニターできる条件の検討を進めた。活発な神経活動が安定に観察できる条件を探索するために、脳組織調製に最適な日齢の検討を行った。また、脳組織調製時に細胞へのダメージを低減させる工夫を行い、細胞の生存率を向上させることに成功した。さらに測定中の培地についても各種イオン濃度などの検討を重ね、安定したシグナル取得が可能となった。ここまで検討した条件で１時間以上の比較的長時間におよぶデータ取得にも成功した。これにより、100種類を超える摂動条件を一斉に評価するためのハイスループットなプラットフォームが整いつつある。さらに、睡眠様状態誘導のための条件について、これまで予定していた生理活性化合物等の利用に加え、ウイルスベクターによる遺伝子発現系を利用することを検討した。これまでの先行研究で同定された睡眠関連遺伝子およびその変異体についてウイルスベクターへの組み込みを行った。ウイルスベクターで使用するプロモーターや、タイターなどの評価を行い、神経細胞へ導入し目的遺伝子を発現させるための基盤が整った。今後は、構築したハイスループット測定系をベースに生理活性物質やウイルスベクターを利用して、睡眠様または覚醒様状態を効率的に誘導できる系の構築を目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

各分子の睡眠制御への寄与を正確に評価する上で、安定した実験系構築は必須である。神経シグナルの測定条件は固まってきている一方で、睡眠誘導のための条件については未だ不確定な部分が残っているため、今後の課題であると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

睡眠誘導のための条件検討については、引き続きウイルスベクターによる遺伝子導入も含めて検討を続ける。近年、In vivoにおいて顕著に睡眠誘導に働く遺伝子変異体も見い出されており、それらを中心に複数の遺伝子について検討を行う。神経シグナルの取得条件について、現在の蛍光色素を利用する方法では、数時間を超える長時間測定への適応が困難であることも考えられる。今後は膜電位やカルシウムインジケーターを発現する遺伝子改変動物の脳組織を利用する方法や、遺伝子改変ES細胞から神経系への分化誘導を行うことも検討する。

Causes of Carryover

今年度はすでに保有していた試薬等を使用したため、予定していた消耗品への支出がなかった。また、学会参加を予定していたが、COVID-19の影響もありキャンセルした。予定していた消耗品ほか実験用動物の購入のために次年度に合わせて使用する計画である。