2019 Fiscal Year Research-status Report

過剰なMgイオンによるミトコンドリアのエネルギー代謝異常とがん悪性化

Research Project

Project/Area Number	19K16125
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	橋爪脩大阪大学, 微生物病研究所, 特任研究員(常勤) (50755692)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ミトコンドリア / ATP / ROS / Mg2+ / トランスポーター / CNNM
Outline of Annual Research Achievements	細胞内のMg2+を排出するトランスポーターCNNMをノックダウンしたHEK293細胞株やCNNMのMg2+排出機能を抑制する因子PRLを過剰発現するHCT116細胞、細胞内へのMg2+取り込みチャネルTRPM7の過剰発現したHEK293細胞において細胞内Mg2+の過剰蓄積とミトコンドリアでのROSレベルの上昇が引き起こされることがわかった。さらに、CNNMをノックダウンした細胞やPRLの過剰発現細胞でATPレベルを測定すると上昇していることが明らかになった。そこでPRLを薬剤誘導で発現する細胞にFRETタイプのATP感受性蛍光プローブATeamを発現させ継時的な細胞内ATPレベルの変化を調べた結果、PRLのタンパク質量の増加に合わせてATPレベルが徐々に増加していくことがわかった。これまでにCNNM変異体線虫でROSレベルとATPレベルが増加することを明らかにしており、本年度の研究成果と合わせてCNNMのMg2+排出機能低下によるROSとATPレベルの上昇が種を超えて共通の現象であることが示唆された。CNNMノックダウン細胞だけでなくPRLやTRPM7の過剰発現細胞でもROSとATPレベルの上昇が起きたこと、PRLのタンパク質量の増加に応じてATPレベルが上昇したことから細胞内でのMg2+過剰蓄積がROSとATPレベル上昇の原因であることが考えられ、細胞内のMg2+レベルの変化はエネルギー代謝やROS産生に大きく影響を与えることが示唆された。細胞内のMg2+レベルが複数のトランスポーターやチャネルによる取り込みと排出のバランスにより厳密に制御されている意義や細胞内Mg2+レベルの調節の医学生物学的重要性を理解する上で重要な知見を得ることができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 複数の細胞株、複数の細胞内のMg2+レベル制御因子を用いて、細胞内での過剰なMg2+蓄積によるATPやROSレベルの増加が一般的な現象であることが確認できており、培養細胞での詳細なメカニズム解析やノックアウトマウスでの解析でも当初の計画通りに実験を進めていくことが期待できる。そのため概ね順調に進展していると自己評価した。
Strategy for Future Research Activity	ミトコンドリアでのROSレベルが上昇していたことから、CNNMノックダウン細胞でミトコンドリア呼吸機能の解析を行う。また、阻害剤を用いてミトコンドリアでのROSの発生源の特定を行う。さらに研究室で樹立されているCNNM4ノックアウトマウスでもROSの過剰酸性を引き起こされているか調べ、培養細胞で確認された現象が哺乳類生体内でも確認できることを確認する予定である。
Causes of Carryover	研究室にある試薬、物品を最大限利用することで今年度の執行額を大きく節約することができた。研究計画に変更はなく、前年度の研究費は新たな抗体や試薬の購入に利用し、当初の予定通りの計画を進めていく。