2020 Fiscal Year Research-status Report
生体内血管リモデリング：血流刺激に対する血管内皮細胞の感知応答機構の解明
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19K16140
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高瀬 悠太 京都大学, 理学研究科, 特定助教 (70756478)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 生体内血管リモデリング / 血管パターニング / トリ胚 / 細胞挙動 / 血流ずり応力 / TGFbシグナリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、血管内皮細胞において血流刺激の感知・応答に関わる分子群を探索・同定する実験を実施した。その結果、TGFβ1ーALK1・ENGシグナルシグナリングが血流刺激の感知機構として働くことが示唆された。
生体内への異所的な血流刺激誘導に利用可能な流体ずり応力刺激装置の検討実験を行い、シンプルな灌流用ポンプシステムを導入することを決めた。
この他、血管内皮細胞の血流に対する細胞応答の指標となる「同一細胞内における核ーゴルジ体の位置関係」を可視化・評価するため、免疫染色と組織透明化を組み合わせた手法の最適化に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は、前年度の結果から血流刺激の感知・応答に関わる分子群として働くことが示唆されたTGFβシグナリングについてさらなる検証を実施した（膜タンパクPlexinD1については、ノックダウン実験の結果が安定しなかったため、TGFβシグナリングの解析に集中した）。そして、合成siRNAを用いた血管網におけるノックダウン実験の結果、TGFβシグナリングの受容体であるALK1とENGが動脈リモデリングに必要であることが見出された。この動脈リモデリングにおけるALK1・ENGシグナルの重要性は、九州大学・大川恭行博士の協力で実施した、動脈リモデリング前後の血管組織におけるRNAseq解析結果からも示唆された。加えて、ALK1のリガンド候補であるBMP9・10およびTGFβ1の役割について解析した結果、BMP9・10は動脈リモデリングに対して負に働くことが示唆された。TGFβ1に関しては前年度の実験結果によって動脈リモデリングに対して正に働くことが示唆されているため、TGFβ1ーALK1・ENGシグナルが血流刺激の感知機構として働いている可能性が高い。
また、生体内への異所的な血流刺激誘導に利用可能な流体ずり応力刺激装置として、東海ヒット社の低圧灌流・拍動定圧灌流用ポンプシステムBPUの利用を検討した。業者との打ち合わせを経て複数回のデモ実験を行った結果、ニワトリ胚血管とポンプシステムとを接続するガラスキャピラリーの問題で高性能なポンプシステム機能を活かせないことがわかった。そこで今年度に研究費を繰り越した上で、東海ヒット社または別会社のよりシンプルな灌流用ポンプシステムを導入することを決めた。
この他、血管内皮細胞の血流に対する細胞応答の指標となる「同一細胞内における核ーゴルジ体の位置関係」を可視化・評価するため、免疫染色と組織透明化を組み合わせた手法の最適化に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、当該年度までの結果から見出された血流刺激の感知機構TGFβ1ーALK1・ENGシグナルの詳細および血流刺激の応答分子候補RhoAとの関連性を調べることを予定している。具体的には、RhoAレポーターGFP-rGBD（活性化型RhoA結合配列が付加されたGFP）の遺伝子導入と同時にALK1・ENGのノックダウンや恒常活性化/不活性化変異体の遺伝子導入を行い、感知・応答機構の連携を1細胞レベルで解析する（この際、核ーゴルジ体の位置関係なども可視化・評価する）。そして、これらの研究成果を今年度中に論文として投稿する。
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| Causes of Carryover |
本来、該当年度中に生体内やin vitro培養環境下で血流刺激を与えることが可能な流体ずり応力刺激装置を購入し、血流刺激の実体解明を進めるための解析系を確立する予定だったが、新型コロナウイルス感染拡大に伴う活動制限対策のため、関連業者との相談や機器の検討実験に十分な時間が割けられなかったため、研究計画を変更した。今年度に研究費を繰り越した上で別の流体ずり応力刺激装置（シンプルな機能の灌流用ポンプシステム）を導入する計画を立てている。
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