2019 Fiscal Year Research-status Report
マウス初期発生におけるdisallowed genesの解析
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19K16151
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
添田 翔 沖縄科学技術大学院大学, 細胞シグナルユニット, 研究員 (40783858)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 初期発生 / 卵細胞 / mRNA制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
卵細胞特異的CNOT1 KOマウスから卵細胞を回収し、そのphenotypeの観察を行なった。ホルモン投与により排卵誘導を行いMII期卵細胞の採卵を試みたところ、回収された卵の多くがMII期に進行していなかった。正常なspindleの形成もできておらず、人工受精後の発生もほとんどが一細胞期で停止していた。GV期卵細胞を回収しGV期からMII 期への発生をライブイメージングにより観察を行なったところ、減数第一分裂進行割合、タイミング、染色体分配に異常が見られた。したがってCNOT1 KO卵細胞はGV-MII期移行に異常を起こすことがわかった。これまでに報告されているmaternal mRNA分解に関わる因子のノックアウト卵細胞よりも、より早期に異常が見られることがわかった。
GV期およびMII期のWT、CNOT1 KOおよびCNOT7 KO卵細胞を回収し、RNA sequencing解析を行なった。解析の結果、当初の予想通りCNOT1 KO、CNOT7 KOでmRNAの安定化が起きていること示唆する結果が得られた。この解析の結果、CNOT1 KO卵細胞のphenotypeの原因候補として約800遺伝子が得られた。今後、CNOT6&6L KOおよびCNOT7&8 KO卵細胞のRNA sequencing解析を行い、その結果を用いてさらなる絞込みを行う。
CNOT6&6L KO卵細胞の解析に関して、RNA sequencing解析に必要な数の卵細胞の採集を完了した。今後このサンプルを用いてRNA抽出、sequencing library調整、RNA sequencingを行う。
掛け合わせにより卵細胞特異的CNOT7&8 KOマウスの作出を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通りWT、CNOT1 KO、CNOT7 KO 卵細胞のRNA sequence解析を行なった。解析の結果、約800の候補遺伝子が得られたが、CNOT1 KO phenotypeの原因特定には至っていない。しかしこの段階での進度としては当初の計画から予想していたくらいであり、進展状況に問題はない。
CNOT7&8 KOマウスの作出を完了したが、当初の計画より遅れており、まだその卵細胞の採集やphenotypeの解析は行えていない。年度末に新型感染症の影響による動物飼育施設の利用制限、飼育頭数制限等があり、このことも少なからず計画の遅れの要因となった。現在は動物飼育施設の利用制限は解除されており、また再び制限がかかっても計画に必要なマウスを繁殖する準備は整っており、計画を遂行できるものと考えている。
CNOT1 KOの発生異常を起こす時期の特定をほぼ完了できた。一方でこれまでmaternal mRNAの分解に働く因子のノックアウトは1細胞期から2細胞期に発生を停止することがわかっており、今回CNOT1 KOの発生異常の時期は予想外にこれより早期であった。またその発生停止時期は一般にmaternal mRNA分解が起こると考えられている時期より早い時期であり、CNOT1 KOで見られるphenotypeが本当にmaternal mRNA分解の異常により引き起こされたものであるかは今後注意して解析しなければならない。今後CNOT7&8 KOの解析を行うことで、この点については明らかになると期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
CNOT6&6L KO卵細胞のRNA sequencing解析を行う。解析用のサンプルは採集完了しており、計画通り解析完了できると考えられる。
CNOT7&8 KO卵細胞のRNA sequencing解析および発生異常について解析する。CNOT1 KO卵細胞で行なった解析と同様の解析をCNOT7&8 KO卵細胞を用いて行う。当初の計画より遅れているが、CNOT1 KOを用いた解析の実施状況から考え、マウスの交配頻度を上げることでこちらの計画も予定通りに完了することができると考えている。また、CNOT7&8 KO卵細胞のphenotypeとCNOT1 KO卵細胞のphenotypeやこれまでに報告されているmaternal mRNAの分解に働く因子のノックアウト卵細胞のphenotypeを比較し、CNOT7&8 KOとCNOT1 KOどちらがdisallowed genesの解析にふさわしいか判断する。
maternal mRNA分解におけるpoly-(A)分解酵素サブユニットの役割の違いについて解析するために、CNOT7&8 KO卵細胞とCNOT6&6L KO卵細胞をRNA sequencing結果を比較する。またCNOT7&8卵細胞に不活性化型あるいはCNOT6結合不能型CNOT7や8を発現させ、そのphenotypeを観察する。
CNOT6&6L KO、CNOT7&8 KOのRNA sequencing結果を用いてmaternal mRNA中のdisallowed genesを絞り込んだ後、これを確認するためにsiRNA処理を行う。同定が行えた場合はそれらについて共通する配列を調べ、制御機構を考察、解析する。
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| Causes of Carryover |
研究進展状況の遅れにより、当初予定していたCNOT7&8 KO卵細胞のRNA sequencing解析および観察が行えず、そのための費用を次年度に使用することとした。
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