2019 Fiscal Year Research-status Report
代償的に誘導される転写の制御機構の解明：体節形成を制御するMespをモデルとして
| Project/Area Number |
19K16152
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Genetics |
|---|
Principal Investigator |
岡田 甫 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 博士研究員 (10835036)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 遺伝子代償 / 転写 / 近接遺伝子 / 体節 / ゲノム構造 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Mesp遺伝子の代償機構でなぜ体節が形成されないのかを明らかにするため、体節誘導系を用いた。まず、この体節誘導系において、Mesp遺伝子の代償機構が再現できるのかを、欠失するゲノム領域の異なる幾つかのMesp2欠損ES細胞による体節誘導系にて、検証した。その結果、欠失させるゲノム領域によって、Mesp1が代償的に発現上昇するかどうかが異なることが明らかになった。近年、変異を有した遺伝子がNMD機構によりRNAレベルで分解され、その下流の機構により相同性のある代償作用をもつ遺伝子が誘導されることが明らかになった（M. El-Brolosy et al. Nature 2019）。しかしながら、今回使用したMesp2欠失株では、NMD機構によるMesp2のRNA分解は誘導されない。そのため、代償的にMesp1が誘導されるのかどうかは、Mesp2のエンハンサーが残存するか否かによる可能性が浮上した。Mesp1とMesp2は同一染色体上で隣合って配置されている。申請者は、隣り合う相同遺伝子による遺伝子補償モデルを立てている。Mesp2エンハンサー領域が相互作用するゲノム領域がMesp2遺伝子の欠失前後で変化がないか、enChIP法 (Genes to Cells, T. Fujita et al., 2017) を用いて、このモデルを検証している。相同遺伝子は遺伝子重複により生まれており、相当数の相同遺伝子対が隣りあうことをBioinformatic解析により明らかにした。このことから、この新たな補償モデルはMesp遺伝子以外にも適用できる可能性がある。
代償的に誘導されるMesp1の発現タイミングを解析するために、MS2システムを利用した系の立ち上げを行ったが、これまでMesp1/2の転写の可視化には至っていない。現在系の改良を検討中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Mesp遺伝子の代償機構でなぜ体節が形成されないのかを明らかにするため、幾つかのMesp2欠損ES細胞による体節誘導系にて、代償機構の再現を狙った。これには成功し、かつNMD機構に依存しない、隣接する遺伝子間のエンハンサーを介した、新たな代償的機構の存在を示唆する結果が得られた。研究開始当初予定していなかった結果が得られたので、ゲノム間相互作用を解析するenChIP法を導入して、隣接する遺伝子間でのエンハンサーの嗜好性の変化を明らかにしようとしている。
しかしながら、当初明らかにしようとしていた代償的に誘導されるMesp1が内在性のMesp2に比べて遅れ、体節形成を救済できない可能性を検討できていない。Mesp1とMesp2の転写をMS2・PP7システムを用いることで可視化し、Mesp2欠損時にMesp1が上昇する発現時間を計測しようとしたが、転写の可視化に至っていない。原因として、体節誘導系で発現するMesp遺伝子の発現量が低かったのだと考えられる。そこでMesp2の上流制御因子であるTBX6とNotchシグナルを任意のタイミングで過剰発現するES細胞の作成を行った。期待通り、Mesp2の発現量を上昇させることに成功した。
このように新しい結果も得られた一方で、本研究で非常に重要な要素となる、転写の可視化に成功していないので、この進捗状況となった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
新たに提唱している「隣接する遺伝子間のエンハンサーを介した遺伝子代償機構」を実証する。具体的にはMesp2エンハンサーを認識するgRNAとタグ付きdCas9を利用して相互ゲノム領域を同定するenChIP法を用いて、Mesp2欠失後にMesp2エンハンサーがMesp1のプロモーター領域と作用するようになるかどうかを確かめる。
Mesp1とMesp2の転写をMS2・PP7システムを用いることで転写のライブイメージングによる可視化を行うが、現在Mesp2の上流制御因子であるTBX6とNotchシグナルを任意のタイミングで過剰発現するES細胞の作成を行い、Mesp2の発現量を上昇させることに成功した。今後はこの細胞にMS2システムを導入し、可視化を試みることになる。可視化の系が動けば、その細胞にてMesp2を欠失させ、Mesp1が内在性のMesp2に比べてどのくらい遅れて発現するのかを検証する。
転写のライブイメージング可視化に加えて、高感度in situ hybridization法によるMesp遺伝子の定量化を行う。これにより代償的に誘導されるMesp1の発現量がMesp2を補うのに十分であるかを評価する。
|
| Causes of Carryover |
今年度は所属する研究室に元々あった血清や培地を使用することができたため、当初の予定より使用しなかった。
次年度はin vitro培養系で得られた結果を確認するために、マウスを作成予定であり当該年度に使用しなかったものを使用する。
|
