2019 Fiscal Year Research-status Report
膜電位の可視化による植物の膜電位シグナリング機構の解明
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19K16164
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
吉成 晃 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 研究員 (00829872)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 膜電位 / 蛍光イメージング / シロイヌナズナ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物はストレスや環境刺激に応答し、膜電位変化を伴った比較的速い細胞間・組織間のシグナル伝達を行うことが知られている。本研究の目的は、植物の膜電位を可視化する蛍光センサーを開発し、植物における膜電位分布と様々な環境刺激に応答した膜電位の変化をリアルタイムにモニタリングすることにある。植物細胞における膜電位イメージングを達成するためには、植物がもつ膜電位域（-200ー-60 mV）で反応性を示す膜電位センサーを新たに作る必要がある。2019年度は、神経細胞研究で用いられる膜電位センサー・FlicR1やMermaid2に様々なアミノ酸置換変異を導入し、反応可能な膜電位域の最適化に挑んだ。哺乳類細胞を用いたパッチクランプ解析によって、FlicR1のVoltage-sensing domainへの１アミノ酸置換またはVoltage-sensing domainの第2膜貫通ドメインと第3膜貫通ドメインの間のループ領域へのアミノ酸配列挿入によって膜電位域が改善されることが分かった。これらの変異型FlicR1をタバコ葉表皮細胞に発現させたところ、正常に細胞膜に局在することが分かった。ユビキチンプロモーターや花粉特異的プロモーター下でこれらを発現するコンストラクトを作製し、シロイヌナズナに形質転換し、これまでに多数のT2世代植物を得ている。2020年度は、シロイヌナズナ形質転換体を用いたin plata解析を進める。また、既存のセンサーをさらに改良するために、PCRランダム変異導入や蛍光タンパク質の変更などを行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初はパッチクランプ解析に必要な哺乳類細胞を用いた実験系の確立に手間取った。また、孔辺細胞特異的プロモーターやp16プロモーターなどをもつ一部の自作ベクターが期待通り植物体内で発現しないという問題があり、コンストラクトをやり直している。
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| Strategy for Future Research Activity |
膜電位センサーを安定的に発現するシロイヌナズナ形質転換体を作出し、生細胞イメージングに取り組む。また、PCRランダム変異導入、大腸菌を用いた蛍光レベルの評価、フィールド電位刺激による哺乳類細胞における膜電位応答性の評価によって、改良型センサーを作製する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症による日本植物生理学会の中止に伴う旅費の減少が原因。2020年度のDNA合成にかかる費用に充てる。
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