2020 Fiscal Year Research-status Report
Combining Ca2+/H+ imaging and electrophysiology in Drosophila circadian pacemaker neurons
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19K16185
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
森岡 絵里 富山大学, 学術研究部理学系, 助教 (80756122)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ショウジョウバエ / 中枢時計ニューロン / 蛍光タンパク質 / イメージング / 細胞内プロトン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに、1波長励起1波長蛍光Ca2+センサータンパク質（GCaMP6s）、1波長励起2波長蛍光レシオメトリック蛍光Ca2+センサータンパク質（Yellow cameleon 2.1）および1波長励起2波長蛍光レシオメトリック蛍光pHセンサー（deGFP4）を用いたCa2+/H+イメージングにより、哺乳類の時計中枢とは異なり、ショウジョウバエの中枢時計ニューロン（LNs）においては、細胞内Ca2+よりもむしろ細胞内H+濃度が概日振動していることを明らかとした。これは、単にLNsにおける細胞内H+濃度リズムの存在を新規に明らかにしたという点だけではなく、1波長励起1波長蛍光Ca2+センサーの変化がCa2+ではなくH+に起因することを示したという点で重要である。GCaMPをはじめとする1波長励起1波長蛍光センサータンパク質は幅広い研究分野で利用されているが、多くのユーザー研究者は、GFPベースの蛍光センサータンパク質が持つpH依存性についてほとんど認識していない。よって、本研究成果は分野を超えてインパクトが大きく、より多くの研究者に読まれる成果発表が求められる。
そこで、当該年度においては、ショウジョウバエLNsには概日H+振動が存在することに加え、このH+リズムがミトコンドリアイオントランスポーター（LETM1）のノックダウンにより抑制されること、哺乳類の時計中枢である視交差上核ニューロンの概日Ca2+振動がLetm1ノックダウンにより減少すること、末梢時計モデル細胞株のミトコンドリアCa2+取り込みがLetm1ノックダウンにより減少することなどを突き止めたこれまでの研究成果を合わせ、生物種を超えた中枢時計ニューロンの細胞内イオン制御機構についての一つの学術論文としてまとめ、投稿した。現在、リバイズ実験中であり、最終年度での論文発表を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度において、これまでの研究により得られた、ショウジョウバエ中枢時計ニューロンを用いたCa2+/H+イメージング、行動リズム解析、時計遺伝子発現解析および電気生理学実験の結果を中核として、哺乳類時計中枢であるラット視交差上核ニューロンおよびヒト網膜色素上皮細胞モデルを用いたCa2+/H+イメージングや遺伝子発現解析結果も合わせ、生物種を超えた中枢時計ニューロンの細胞内イオン制御機構についての研究の集大成として、一つの論文として投稿、リバイズの指示が返ってきたところまで至っており、研究全体の進捗状況としては順調に推移しているものと考えられる。
また、本研究と共通のイメージング装置を用いた派生的研究として、2種の摂食制御ペプチド：コレシストキニンとレプチンの相互作用の解明を試み、2種の神経ペプチド間の方向性を持った細胞内情報伝達の相互作用を明らかにした。これらの研究成果は、当該年度において論文および図書として発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度では、まず、論文受理を目指した実験を進める。これまでの研究により、LNs特異的なLetm1 RNAi発現が、LNsの細胞内H+リズムの抑制、歩行活動リズムの長周期化、時計遺伝子発現リズムの位相後退を引き起こすことを明らかとしたが、RNAiにより当該遺伝子が抑制されているかどうかは未確認である。そこで、全神経特異的ドライバー（Elav-Gal4）あるいは時計細胞特異的ドライバー（tim-Gal4）を用いてLetm1 RNAiを発現させたトランスジェニックバエを作出し、リアルタイムRT-PCR法により、RNAiによるLetm1遺伝子のノックダウン効果を評価する。また、ホールセルパッチクランプ解析により、LNsの神経発火頻度が細胞外pH依存的に変化することを観察したが、細胞外pHの変化により、緩衝作用を持つ細胞内pHがどの程度変化しているかは不明であった。ホールセルモードで直接的に細胞内pHを変化させることはできないため、蛍光pHセンサー（deGFP）の蛍光輝度を指標として、細胞内-外pHの相関関係をキャリブレートし、細胞内pH推定を試みる。
概日時計の一般的特性として、周期が温度に影響されない（温度補償性）ことが知られている。LNs特異的Letm1ノックダウン系統の行動リズム解析の過程で、温度補償性を評価したところ、低温（19度）条件下では、通常温度（24度）条件で見られた自由継続周期の長周期化が観察されない可能性が示された。Letm1は若年性パーキンソン病の原因遺伝子PINK1を介してリン酸化されることが報告されている。そこで、PINK1あるいはPINK1と密接に関係するParkinに対する変異体を用いた同様の解析も行い、温度補償性機構におけるLetm1とミトコンドリア機能の役割や、パーキンソン病モデルにおける温度補償性についても解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
学会がオンライン開催となったため、旅費がかからず未使用額が生じた。これまではショウジョウバエの行動リズム記録に自動歩行活動記録装置（DAM2、TriKinetics社）3台を用いてきたが、今後、複数の変異体系統を用いた行動リズムの温度補償性異常についてより効率的に記録・解析するため、未使用額は自動歩行活動記録装置の追加購入資金の一部とし、行動リズム記録システムの拡充経費としたい。
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