2019 Fiscal Year Research-status Report
In vitro evolution of a peptide-ribozyme complex catalyzing aminoacylation
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19K16200
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
寺坂 尚紘 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任助教 (40830071)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 分子進化 / リボザイム / ペプチド / RNA ワールド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プロジェクト初年度である2019年度は、アミノアシル化を触媒するペプチド・リボザイム複合体の試験管内分子進化実験系を立ち上げた。
TboxzymeはtRNAに結合する天然のRNA配列（T-box riboswitch）から進化させた人工アミノアシル化リボザイムであり、tRNAのD-loopとアンチコドンを認識し、ビオチン化フェニルアラニンを基質として用いる。
Tboxzymeは高い塩濃度が活性に必要であるが、生理的条件下でもわずかにアミノアシル化活性があることが判明した。そこで生理条件下でのTboxzymeのアミノアシル化活性を向上させるための分子進化実験を行った。
Tboxzyme,基質のtRNA,ペプチドライブラリーをコードしたmRNAを一つにつなげたRNAライブラリーを設計し、PCR・in vitro転写によって調製した。ペプチドライブラリーとしては完全ランダムな15アミノ酸配列を用いた。リボザイムとmRNAの間のリンカー配列、逆転写・翻訳などの各種反応条件を検討した結果、RNAライブラリーにピューロマイシンを連結したプローブを用いて、ペプチド・リボザイム複合体のライブラリーを調製することに成功した。基質アミノ酸であるビオチン化フェニルアラニンとペプチド・リボザイム複合体ライブラリーを混合し、低温・短時間で自身の3'末端をアミノアシル化する配列を濃縮し、逆転写PCRによってDNAに変換した。この一連の操作を10回程度繰り返し、次世代シーケンサーで配列解析した結果、数種類のペプチド配列が濃縮されていた。試験管内翻訳系を用いた半定量的なアミノアシル化実験によって、Tboxzymeのアミノアシル化活性を向上させる候補ペプチド配列を1種類同定した。候補ペプチドの詳細な機能解析は現在進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、ペプチド・リボザイム複合体の分子進化系の構築に成功した。また、構築した分子進化系で実際にペプチドの分子進化を行うことで、アミノアシル化リボザイムの活性を上昇させる候補ペプチドの同定に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、同定された候補ペプチドを化学合成し、、in-line probingや表面プラズモン共鳴法によって詳細な機能解析を行う。Tboxzymeの活性を向上させる有望なペプチドを同定できた場合、さらに変異を加えて再び分子進化実験を行うことで、リボザイムの活性向上能を上昇させる。また、分子進化実験でのバッファー条件・アミノアシル化反応温度・反応時間を変えることで、条件の違いによって異なる候補ペプチドを得ることを試みる。
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