2020 Fiscal Year Research-status Report
In vitro evolution of a peptide-ribozyme complex catalyzing aminoacylation
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19K16200
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
寺坂 尚紘 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任助教 (40830071)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 分子進化 / リボザイム / ペプチド / RNAワールド / アミノアシル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プロジェクト二年目である2020年度は、1年目で得られたアミノアシル化リボザイムの活性を向上させる候補ペプチドの機能解析を試みた。また1年目に立ち上げたペプチド・リボザイム複合体の試験管内分子進化実験系に、非天然アミノ酸も含むペプチドライブラリーを適用して、アミノアシル化リボザイムの活性を向上させるペプチドの開発に取り組んだ。
TboxzymeはtRNAに結合する天然のRNA配列（T-box riboswitch）から進化させた人工アミノアシル化リボザイムであり、tRNAのD-loopとアンチコドンを認識し、ビオチン化フェニルアラニンを基質として用いる。Tboxzymeは高い塩濃度が活性に必要であるが、生理的条件下でもわずかにアミノアシル化活性があることが判明した。そこで生理条件下でのTboxzymeのアミノアシル化活性を向上させるための分子進化実験を行っている。
1年目の分子進化実験で得られたペプチドを化学合成し、Tboxzymeのアミノアシル化活性を向上させるかを、ゲルシフトアッセイによって評価した。その結果、化学合成ペプチドを添加してもTboxzymeの明らかな活性向上は見られず、1年目に行った試験管内翻訳系を用いた半定量的な実験とは異なる結果が得られた。これは、試験管内翻訳を用いたアッセイ系ではペプチドとリボザイムはリンカーで繋がっており、分子内相互作用で活性が向上していたためと考えられる。新たな候補ペプチドの探索のため、D体アミノ酸や、原始世界に存在していたと提唱されているアミノ酸を含んだペプチドライブラリーをFlexible in vitro translationシステムによって構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1年目に構築した分子進化実験系を用いることで、分子内相互作用によってリボザイムの活性を向上させるペプチドの探索に成功した。非天然アミノ酸を含む新たなペプチドライブラリーの構築にも成功し、分子進化実験を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目に構築した非天然アミノ酸を含む新たなペプチドライブラリーを用いて、分子進化実験を行う予定である。また、tRNAを認識しつつビオチン化フェニルアラニン以外のアミノ酸を基質として用いることができる、あらたなTboxzymeの開発にも取り組む予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症流行により、2020年度は大学が封鎖される期間が2か月あり、実験できる期間が当初の予定より短くなったため次年度使用額が生じた。次年度使用額と翌年度分として請求した助成金を合わせて、リボザイム・ペプチドの分子進化実験に必要な試薬、解析用機材の購入に使用する計画である。
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