kissing-loopを有する分割型tRNAの創製

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16204
• Research Institution: Tokyo University of Science
• Principal Investigator: 無津呂 裕美 (青木裕美) 東京理科大学, 基礎工学部生物工学科, 助教 (00794570)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: RNA / tRNA / AlaRS / kissing-loop

Outline of Annual Research Achievements

RNAは遺伝情報の保存・伝達の役割の他に、自身が触媒として機能するリボザイムという側面もあわせ持つ。そのため、原始地球においてはRNAがDNAとタンパク質の機能をも受け持つ「RNAワールド」が存在したという仮説があり、初期に機能していたRNAはより単純なものであったと考えられる。
本研究ではRNAワールド時代に存在した単純なRNAから、現在の複雑なタンパク質産生系へと進化した過程を究明する。そこで、申請者はtRNAに着目した。tRNAは、コドンを認識するアンチコドンループ、アミノ酸が付与されるアクセプターステムなどと、複数の機能ドメインを持っており、アミノアシルtRNA合成酵素が、それぞれのtRNAを厳密に認識している。申請者は、別々の機能を持つ短いRNAが結合して複数の機能をもつRNAへと進化したのではないかと考えた。つまり、単機能RNA同士が結合し、それがtRNAと進化したと考えている。本研究では、これを証明するために、分割型tRNAの創製を目指す。
短い非機能性RNA同士をkissing-loopを介して相互作用をさせ、tRNA様の機能を持つRNAを創製する。kissing-loopを介して形成された二分子RNA系が、アラニルtRNA合成酵素（AlaRS）に認識されることを利用して、目的のRNA生成の検出を行う。AlaRSはtRNAに含まれるG-U塩基対を正確に認識するため、2つのRNAが相互作用し、tRNA様の構造を取った場合にのみ、アミノアシル化がおこる。本年度はkissing-loopを有する分割型tRNA様RNAとAlaRSの作製を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度はkissing-loopを有する分割型tRNA様RNAとAlaRSの作製を行った。
分割型tRNAは、kissing-loop部分を7塩基、ヘアピンループ構造を5塩基で形成するように設計した。ネガティブコントロールとして、AlaRSの認識部位に位置する塩基配列を置換したものと、kissing-loopが形成されない変異体も設計した。目的RNAはT7プロモーター配列を付加した合成オリゴを用いて、T7ポリメラーゼによって転写を行った。その転写産物をアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動を行い、目的物を確認したのち精製した。これらの目的物を用いてゲルシフトアッセイを行ったところ、kissing-loopの形成が見られた。
AlaRSはAlaRS 442N変異体を用いた。これは、アミノアシル化部位のみをもつ分子量の小さいAlaRSであり、こちらの方が取り扱いが簡便であるのでAlaRS 442Nを用いた。AlaRS 442Nは大腸菌で発現、培養を行い、HisタグとNi-NTAカラムを用いて精製を行った。SDS-PAGEにより、分子量を調べ、目的物を得た。このAlaRS 442Nにはアミノアシル化活性が認められたため、本実験で用いることが可能である。

Strategy for Future Research Activity

今後は得られた、分割型tRNAとAlaRS 442Nを用いてアミノアシル化検定を行い、kissing-loopを介した分割型tRNAはtRNAとして認識されるかの検証を行う。
また、さらに長いRNAを用いて、分割型tRNAの作製を試みる。

Causes of Carryover

出産と育児のために、予定通りに研究が進まなかったため。また予定していたPCR機を購入することができなかったため。次年度に購入予定である。