バイオフィルムによるアマモ葉への窒素供給メカニズムの解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16236
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 土屋 雄揮 日本大学, 生物資源科学部, 助教 (10636806)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: アマモ / バイオフィルム / アンモニウムイオン / 窒素吸収 / 16S rRNA遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではアマモ葉表面のバイオフィルム（以下、BFと略す）による窒素源の獲得、保持、変換およびアマモへの供給メカニズムを明らかにすることを目的としている。これまでに、BFがアンモニウムイオンを高濃度で内部に保持できる可能性を明らかにしたが、窒素源獲得経路は不明なままである。2020年度は、BF内の窒素源獲得プロセス解明とBFによるアマモの生長促進能解析を予定していた。しかしながら、COVID-19の拡大に伴い、静岡県下田市の日本大学臨海実験所へサンプリングに行くことができず、計画していた実験を遂行することができなかった。そこで、BF内の微生物の由来となる可能性のある１）アマモ葉内部の微生物の群集構造解析法の検討と、実験に使用するアマモを継続的に得ることを可能にするための２）アマモ栽培方法の検討を行った。
１）前年度に採取して冷凍保存してあったアマモの葉を表面殺菌し、細かく切った上でDNAを抽出した。抽出したDNAの16S rRNA遺伝子をシークエンシングした結果、アマモの葉緑体の16S rRNA遺伝子が検出された。アマモ葉内部の微生物の数が少ないか、PCRの条件が合わず微生物が検出されなかったことが考えられた。表面殺菌方法の検討、および葉緑体DNAのPCR増幅阻害の検討を行う予定である。
２）サンプリングに行かずにアマモを得てモデル実験を行うことを考え、アマモ栽培用の海水水槽を立ち上げた。現在、アマモ（代用でリュウキュウスガモだが）の栽培を試みているが、新芽が出て水槽の環境に定着した様子も見られる。今後、アマモを安定して栽培できるようにした上で、栽培したアマモを用いてBFがアマモの生長へ与える影響を調べることを計画している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

2020年度は、BF内における窒素源獲得プロセス解明とBFによるアマモの生長促進能解析のためのモデル実験を予定していた。しかしながら、COVID-19の拡大に伴い、静岡県下田市の日本大学臨海実験所へサンプリングに行くことができず、アマモとBFのサンプルが得られなかった。そのため、計画していた実験を遂行することができなかった。そこで、以下の２つの実験を新たに行った。
１）アマモ葉内部の微生物の群集構造解析法の検討
他の研究で、アマモの葉内部にも微生物が存在することが示されており、BF内の微生物の由来になっている可能性がある。そこで、アマモの葉内部の微生物の群集構造解析を試みた。アマモの葉を表面殺菌し、細かく切った上でDNAを抽出した。PCRで16S rRNA遺伝子を増幅し、TAクローニングでクローンライブラリーを作製した。10クローンほどをシークエンス解析した。その結果、アマモの葉緑体の16S rRNA遺伝子が検出された。アマモ葉内部の微生物の数が少ないか、PCRの条件が合わず微生物が検出されなかったことが考えられた。

２）アマモ栽培方法の検討
サンプリングに行かずにアマモを得ること、それを用いてモデル実験を行うことを考え、アマモ栽培用の海水水槽の立ち上げを行った。海水水槽では通常、微生物（硝化菌）や殺菌灯を用いて水浄化を行う。しかし、本研究では、これらの処理が実験結果に影響を与えてしまうことが考えられた。そこで、砂由来の微生物のみで、殺菌灯も使用せずに水槽環境を保つことを検討した。水槽にライブサンド、人工海水を入れ、植物栽培用のLED電灯、ヒーター、濾過器（無生物素材）を導入して水槽の立ち上げを行った。数日（1週間以内）で藻類（見た目から珪藻類や藍藻類が多い）が繁殖したが、定期的な掃除と水交換により水槽の水の濁りはなくなった。

Strategy for Future Research Activity

今後も静岡県下田市の日本大学生物資源科学部下田臨海実験所においてサンプリングを行い、アマモとBFを採取する予定である。もし、台風やCOVID-19の影響によりアマモが採取できない場合は、購入したアマモを水槽で栽培し、それを用いて実験を行う予定である。現在、アマモ（代用でリュウキュウスガモだが）の栽培を試みているが、新芽が出て水槽の環境に定着した様子も見られる。今後、水槽のサイズを大きくし、海水のろ過を強化して藻類の発生を抑えることを計画している。アマモが栽培でき次第（可能であればZostera marinaを栽培する）、BFが形成されているアマモ葉とBFをはがしとったアマモ葉を準備し、海水中からアマモ葉へのアンモニウムイオンの動態ならびに、アマモの生長の程度と速度を比較することを計画している。また、BF内の微生物は窒素固定以外の経路でN源を得ている可能性がある。メタゲノム解析の結果から、BFへ付着した藻類が殺藻細菌に分解されることによりアンモニウムイオンが他の微生物やアマモに供給されていることが考えられる。BFから殺藻細菌を分離培養してその効果を調べることを検討している。なお、引き続きアマモ葉の表面および内部のメタゲノム解析を行い、N源供給に関係すると思われる微生物の特定を進める。アマモ葉内部の微生物の解析については、表面殺菌方法の検討、および葉緑体DNAのPCR増幅阻害の検討を行う。必要があれば培養法による群集構造解析も検討する。

Causes of Carryover

今年度は、COVID-19の拡大により、日本大学生物資源科学部下田臨海実験所および他所へサンプリングに行けなかったため、計画していた実験の大部分を行うことができなかった。次年度は、当初計画していた実験を行う予定である。
水槽中にアマモ場を再現したモデル実験系を作製し、BFの形成されたアマモ（購入して育てる）と、BFを取り除いたアマモを植え、窒素源（アンモニウムイオン,アミノ酸）を加えて栽培する。このとき、アマモ葉表面の微生物の硝化、アミノ酸取り込みに関する遺伝子（nifH, amoA, nxrB、アミノ酸トランスポーターなど）の発現量の経時変化を、逆転写リアルタイムPCR、FISHによって解析する。可能であれば窒素の移動速度も調べる。また、各アマモの生長（草丈、葉の大きさ、枚数など）を比較することで、アマモの生長にBFがどのような影響を与えるのかを明らかにする。
以上の実験のために、クロマトグラフィー用カラム、次世代シークエンス用タグメンテーションキット、PCR用プライマー、FISH用プローブ、試薬、器具類などの消耗品が必須であり購入する必要がある。