2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of clinically available cyclic peptide-modified liposomes for cancer treatment
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19K16337
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
渕上 由貴 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 客員研究員 (60736403)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ドラッグデリバリーシステム / 標的指向化 / 多色深部イメージング / リポソーム / がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
次世代型の医薬品として能動的ターゲティングに基づく標的指向型リポソームの実用化が望まれているが、製剤の有効性や品質確保・製剤法の観点で未だに課題を残している。申請者らは、トランスレーショナル研究を推進できる規格基準を定めた高機能・高品質な機能性脂質 (HFQ脂質) の開発を進めている。これまでに様々な固形がんに高発現するインテグリンαvβ3を標的とした直鎖ペプチドリガンドであるGRGDSを有するHFQ脂質を開発し、in vitroおよびin vivoにおいて機能性を明らかにしてきた。一方で、直鎖ペプチドは代謝安定性が低いことから実用化に向けた品質の確保・機能性の向上が課題として挙げられる。そこで本研究では、代謝安定性が高いと報告されているインテグリンαvβ3を標的とした環状ペプチドをリガンドとするHFQ脂質を新たに開発し、本脂質を修飾したリポソームのin vivoでの機能性および実用化に向けた超高速ナノ医薬作製装置を用いた製造法の開発を進めている。前年度は、① 反応選択性が高いクリック反応を用いたcyclo(-RGDfK)をリガンドとするHFQ脂質の反応条件の最適化 ② 超高速ナノ医薬作製装置を用いた調製に向けた水への溶解性を有するHFQ脂質の構造の最適化 ③ HFQ脂質を修飾したリポソームの2種類のがん細胞に対する細胞結合性の評価および細胞内動態の解明 の以上３点を達成した。これらの知見は、今年度以降のin vivoでの機能性評価や超高速ナノ医薬作製装置での製造法の確立を迅速におこなえる基盤になると期待する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
固相合成法を用いて、クリック反応の反応点であるアジド基をcyclo(-RGDfK)に、アルキル基をHFQ脂質に導入したものをそれぞれ合成し、クリック反応の反応効率をHPLCで追跡した。この際に、ポストインサートに必要な水への溶解性を考慮するために、HFQ脂質に親水性アミノ酸であるリジンを1個および2個導入したものも併せて合成した。触媒条件の最適化の結果、リジンを2個付与したHFQ脂質を用いることで、約90%と高い反応効率でHFQ脂質の合成に成功した。本脂質は、我々が独自に定める規格基準である0.2mM以上の水への分散性を有したことから、将来的な実用化を見据えた超高速ナノ医薬作製装置での調製も可能であると期待する。本脂質の機能性を明らかにするため、HFQ脂質修飾リポソームのインテグリンαvβ3高発現のマウス由来大腸がんColon26細胞およびヒト由来グリオーマU251-MG細胞を用いた細胞結合性を評価した。その結果、どちらの細胞においてもHFQ脂質の修飾量依存的なリポソームの結合性の向上が認められた。本結果が、リガンド配列選択的であることを確認するために、cyclo(-RGDfK)のネガティブ配列と報告されているcyclo(-RADfK)をリガンドとするHFQ脂質を新たに合成し、細胞結合性を評価した。その結果、cyclo(-RADfK)をリガンドとするHFQ脂質では、未修飾リポソームと同程度まで結合性が減少したことから、cyclo(-RGDfK)配列選択的な細胞結合性であることが示された。細胞内動態を解析した結果、一部がライソソームに局在し、クラスリンおよびカベオラ介在的に取り込まれる可能性が示された。以上、高い反応効率でcyclo(-RGDfK)をリガンドとするHFQ脂質を合成し、細胞実験での機能性を明らかにした。今後は、動物実験での有効性・治療薬への展開を進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までに、cyclo(-RGDfK)をリガンドとするHFQ脂質の高効率な合成法の確立および２種類のインテグリンαvβ3高発現がん細胞株に対して、HFQ脂質修飾リポソームが高い機能性を有することを明らかにした。これらの研究成果を元に今後はin vivoでの機能性の解明およびリポソーム製剤の品質確保・製造法の確立を目指す。具体的な実施内容を以下に示す。
① HFQ脂質修飾リポソームを担がんモデルマウスへ静脈内投与後の経時的な腫瘍集積性の評価および他臓器への集積性評価をin vivoイメージングシステム（IVIS）を用いておこなう。また、ヘテロな構造を有する腫瘍内のリポソーム製剤の分布を空間的に明らかにするため、多色深部イメージングを用いてがん細胞、腫瘍血管との位置関係を解明する。
② 水への溶解性を考慮して設計・開発をおこなったHFQ脂質が、超高速ナノ医薬作製装置を用いて精巧かつ高い再現性でリポソームにポストインサートできる調製法の確立をおこなう。具体的にHFQ脂質の修飾量・装置上での溶液混合比の条件の最適化をおこない、GMP規格化を見据えた調製法の確立を目指す。
③ 腫瘍は、発症部位に応じて様々ながん微小環境を形成することが報告されている。そのため、標的とするがんの種類に応じた戦略が必要となる。超音波応答性ナノバブル製剤と超音波照射の併用は、がん微小環境の間質の除去や細胞内に取り込まれた製剤からの薬物の細胞質への放出に寄与することが報告されている。そこで、ドキソルビシン塩酸塩やパクリタキセルなどの抗がん剤を封入したHFQ脂質修飾超音波応答性ナノバブル製剤を調製し、超音波照射による治療効果の程度を検証する。
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Research Products
(2 results)
