2019 Fiscal Year Research-status Report
セレン結合性タンパク質が関与する心臓のセレン代謝経路の解明
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19K16351
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
吉田 さくら 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 助教 (40736419)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | セレン / 心臓 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セレン欠乏は重篤な心筋障害を起こすことが知られており，心臓におけるセレンの機能は重要であると考えられる。しかし心臓におけるセレン代謝過程については不明な点が多く残されている。そこで本研究は，心臓におけるセレン代謝過程，特に心筋細胞へのセレン取り込み機構を明らかにするため，下記の事項を検討した。
・心筋細胞の培養およびセレノトリスルフィド(STS)取り込み挙動の検討：グルタチオンセレノトリスルフィド(GSSeSG)は生体で確認されている数少ないセレン代謝物の一つである。著者らのこれまでの研究から，GSSeSGと遊離チオール含有タンパク質の反応によるSTSの形成がセレン代謝において重要であると考えられた。GSSeSGは反応性が高く，生理的条件で容易に分解してしまうため，本研究ではGSSeSGのモデル化合物として，ペニシラミンセレノトリスルフィド(PenSSeSPen)を用いた。PenSSeSPenはGSSeSGと同等の性質を有し，かつ生理的条件でも比較的安定して存在するため，STSの代謝過程を明らかにするための有用なツールであると考えられた。PenSSeSPenを含む複数のセレン化合物を，心筋細胞を含む種々の細胞へそれぞれ添加したところ，細胞内に取り込まれ，セレン含有タンパク質であるグルタチオンペルオキシダーゼ活性の上昇が観察され，セレンタンパク質生合成に利用されていることがわかった。
・ミオグロビンの精製：ラットミオグロビン(Mb)には遊離のシステイン残基が一つ存在し，PenSSeSPenとのチオール交換反応によりMb-SSeSPenを形成する。本研究では，Mbに結合したセレンがどのような代謝過程を経るか明らかにするため，ラットの心臓からのMbの精製方法を検討した。分画分子量範囲の異なる複数のろ過膜を用いた限外ろ過法により，電気泳動でMbの単一のバンドを得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・P19細胞の心筋細胞への分化条件の最適化を試みた。既報の1% DMSO以外にも0.5～5%のDMSO濃度での分化誘導を検討した。また分化誘導時の細胞濃度やDMSOとのインキュベート時間についても検討を行った。拍動は観察されなかったものの，既報のような細胞塊が観察された。今後は心臓特異的タンパク質の免疫蛍光染色により，分化を確認する必要がある。また，これらの培養細胞へPenSSeSPenを含む種々のセレン化合物を添加した結果，セレンの細胞への取り込み，およびセレンタンパク質生合成への利用を確認することができた。
・ラット心臓由来セレン結合性タンパク質ミオグロビンの精製
市販のマッコウクジラやウマのミオグロビン(Mb)には遊離チオールが存在しないため，ラットの心臓からミオグロビンを精製する方法を検討した。ホモジナイズ後の心臓細胞質溶解液を超遠心分離し，得られた上清を分画分子量範囲(MMCO)6～8 kDaの透析膜で一晩透析した。その後，MMCO 100 kDaの限外ろ過膜を装着した撹拌式加圧限外ろ過装置でろ過した。さらに得られたろ液をMMCO 30 kDa, 10 kDaの限外ろ過膜で順次ろ過した。MMCO 10 kDaの限外ろ過膜上に残った少量の試料を回収し，電気泳動に供した結果，Mbの分子量である17 kDa付近に単一の明瞭なバンドが確認され，Mbの精製に成功したと考えられる。今後は精製したMbを用いたセレンの代謝過程研究を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
・心筋細胞におけるセレン取り込み過程の分析
心筋細胞へ分化した細胞において，セレン結合性タンパク質であるミオグロビン(Mb)の発現を，質量分析や，特異的抗体を用いた方法により確認する。さらにセレン結合性タンパク質の発現が，細胞へのセレン取り込みやセレンタンパク質生合成へ影響を与えるかどうか，siRNAによるセレン結合性タンパク質のノックダウンなどの方法により検討する。これまでの検討において，神経細胞や肝臓がん細胞などの他の培養細胞と同様に心筋細胞へも，STS由来セレンが取り込まれる可能性が示唆されたことから，STS含有タンパク質と心筋細胞の細胞膜タンパク質とが相互作用する可能性を考慮し，膜タンパク質画分由来セレン結合性タンパク質の探索を検討する。
・ミオグロビンに結合したセレンの動態解析
セレンタンパク質はミトコンドリアにも存在し，特にグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)は，酸素消費の過程で不可避に生成する活性酸素種(ROS)の消去に重要な働きをしている。心筋では脂質をエネルギー源としていることから，多くの脂質過酸化物を生じると考えられる。従って，これらを還元するGPx4が重要であると推察される。Mbへ結合したセレンはチオール交換によりミトコンドリアへ輸送される可能性があることから，遠心分離等によりミトコンドリア画分を精製し，精製したMbを用いて調製したMb-SSeSPenと混合後，セレンのミトコンドリアへの移行，セレンタンパク生質合成への利用を調べる。
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| Causes of Carryover |
（理由）
消耗品や試薬の価格変動や実験研究の進行状況により，残高が発生した。
（使用計画）
次年度の消耗品や試薬の購入に使用を予定している。
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Research Products
(5 results)
