2020 Fiscal Year Research-status Report
ストレスメディエーターClaspinによるストレス反応の統合的な制御機構の解明
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19K16367
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
楊 其駿 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (80792647)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Claspin / ストレス応答 / 仲介分子 / 複製ストレス / 血清飢餓 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Claspinは複製障害ストレスに対する細胞応答経路でATRからChk1へとシグナルを伝えるmediatorとして機能する。本研究では、これらのプロセスでのClaspinの詳細な機能を解明するとともに、Claspinが種々のストレスに対する細胞応答を統合的・協調的に制御するメカニズムを分子レベルで解明することを目的とする。
本研究では、種々のストレス細胞応答におけるClaspinの仲介分子としての機能解明に関して研究をした。
Claspin欠損細胞では、血清飢餓からの増殖再開が障害を受ける。マス解析で見つけた血清飢餓への応答するClaspinリン酸化サイトが見つかった。さらにリン酸化以外のClaspinは修飾する可能性が見つかった。血清飢餓と血清飢餓からの増殖再開への応答はChk1経由しないことを発見した。Claspinは栄養応答シグナル伝達系に関与するmTOR、PI3 kinase、PDK1と相互作用することを見出した。そのうち、血清飢餓中PDK1とClaspin結合し、血清飢餓からの増殖再開と、mTORとClaspin結合することがわかった。更に、PDK1は血清飢餓中リン酸化以外の修飾の可能性が発見した。
血清飢餓の増殖再開時にClaspin欠損細胞のp53タンパク質は大量発現する。p53阻害剤を処理した時、生存率は高くなった。Claspinはp53を通じて、血清飢餓のストレスを応答することが分かった。
RNA-seqでの解析による、Claspin欠損細胞では血清飢餓からの増殖再開のアミノ酸の合成や代謝に関するタンパク質発現量が減った。ClaspinはPDK1/mTOR伝達系を制御する、アミノ酸の合成や代謝を影響し、血清飢餓のストレスに応答すると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．血清飢餓への応答におけるClaspinの役割:Claspin欠損細胞では、血清飢餓からの増殖再開が障害を受けるという現象だけでなく、Claspinが血清飢餓からの増殖再開が障害のストレスに対する細胞応答を制御するメカニズムを分子レベルで徐々に解明する。
血清飢餓と血清飢餓からの増殖再開への応答に対し、ClaspinはATR/CHK1ルートではなく、新しいPDK1/mTOR/p53ルートが見つかった。更に、ClaspinとPDK1/mTOR結合位置とタイミングも解明した。その結果で血清飢餓への応答にPDK1/mTOR経路でアミノ酸合成や代謝を制御するメカニズムを見出した。
２．他のストレスへの細胞応答におけるClaspinの役割：これまでの実験結果から様々なストレスシグナル（酸素ストレス、浸透圧、温度と細菌毒素）はDNA複製を阻害し、Claspinは種々のストレス存在下で、下流Chk1のリン酸化を促進することが分かった。正常細胞と様々な癌細胞はそのストレスに対し、Chk1のリン酸化を促進程度が違いことが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.血清飢餓への応答におけるClaspinの役割:血清飢餓と血清飢餓からの増殖再開への応答に対し、ClaspinはATR/CHK1ルートではなく、新しいAKT/mTOR/p53ルートが見つかったが、詳しいルートの順番と機能はまだわかっていない。マス解析で見つけた血清飢餓へ応答するClaspinリン酸化サイトが見つかった。今後そのサイトの変異Claspinを作って、PDK1/mTORとほかのルート関連タンパク質に対してどんな影響が出るか解明する。Claspinは清飢餓と血清飢餓からの増殖再開への応答に対し、リン酸化以外の修飾も解明していく。
2.他のストレスへの細胞応答におけるClaspinの役割：Claspinは種々のストレスシグナル（酸素ストレス、浸透圧、pH、温度、核小体ストレス、小胞体ストレスなど）を下流に伝達する可能性を想定している。そこで、種々のストレス存在下でのClaspin相互作用分子をより網羅的に同定する。これらの中には、特定のストレス応答におけるClaspinの上流、下流分子が含まれる可能性があるが、その中からさらに解析する候補を選定する。同定され、選定された分子が、実際に、当該ストレスへの細胞応答に必要かどうかを検討するために、CRISPR/Cas9ノックアウト細胞、あるいは、siRNAを用いて発現抑制を行う細胞系を確立する。Claspinと、同定された上流センサー分子、下流エフェクター分子との相互作用部位をClaspin上でマップする。同定された相互作用部位の変異体Claspinを作製し、それらが特定のストレス応答に欠損を示すか検討するための準備実験を行う。代表者の研究室で作製した、Claspinの臓器特異的ノックアウトを用い、個体レベルでのストレス応答に及ぼすClaspinの影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
RNA-seqの費用や様々なストレスに対するDNA複製速度やoring firing発現する技術DNA fiber解析を早めに進めるために、高価な機械を使用する。
マス解析で見つけた血清飢餓へ応答するClaspinリン酸化サイトが見つかり、今後そのサイトの変異Claspinを作るために、長いDNA配列の合成が必要。
更に、PDK1/mTORとほかのルート関連タンパク質に対してClaspinとの作用を見つけるため、大量多種類な抗体が必要ため。
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