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2019 Fiscal Year Research-status Report

PBP type-TEのペプチド環化触媒能の解明と環状ペプチドの多様性拡張

Research Project

Project/Area Number 19K16390
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

松田 研一  北海道大学, 薬学研究院, 助教 (50812301)

Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords環状ペプチド / ペプチド環化酵素 / 生体触媒 / 非リボソームペプチド合成酵素 / 放線菌
Outline of Annual Research Achievements

官能基選択的、位置選択的なペプチド環化反応を効率よく触媒する環化酵素は、環状ペプチド効率合成にむけた生体触媒としての応用が期待できる。
我々はこれまで、放線菌の非リボソーム型環状ペプチドsurugamide類の生合成における新しいタイプのペプチド環化酵素SurEを見出し、その寛容な基質選択性を明らかにしてきた。一般的なNRPS経路の環化酵素は数MDaにおよぶ巨大酵素のC末端に融合して存在するのに対し、SurEは50 kDa程度でありNRPSから独立して存在する「単独酵素」である。SurEは一般的なNRPS環化酵素と相同性を示さない一方、ペニシリン結合タンパク質(PBP)に相同性を示すことから、我々はこれを新規ペプチド環化酵素ファミリー「PBP-type TE」として位置づけてきた。データベース検索の結果、様々な基質選択性を有するPBP-Type TEの一群が放線菌ゲノム中に見出された。そこで本研究では、これによって生合成される多様な天然環状ペプチドを同定し、各環化酵素の基質選択性の詳細な解析を行うことで、放線菌に広く分布したPBP-type TEファミリーの多様性の全容解明を目指す。本研究で得られる成果は、汎用性の高いペプチド環化触媒のライブラリー化、さらには基質選択性を拡張する触媒エンジニアリングへと展開することが期待される。また本研究では、PBP-type TEを利用したNRPSエンジニアリング手法の検討も行う。
今年度は、機能未知のPBP-type TEのクローニングを行い、それらの環化活性を評価した。これに加え、改変したNRPSとPBP-type TEを組み合わせることで、非天然型環状ペプチドの生物合成を試みた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PBP-type TEは10%程度の放線菌が有する普遍的な生合成機構であり、これにより様々な環状ペプチドが生合成されると考えられる。個々のPBP-type TEの基質選択性を明らかにすることを目的に、PBP-type TE遺伝子を有する放線菌株を購入し、PBP-type TE遺伝子のクローニングを行った。これにより、3種類のPBP-type TEの組換えタンパク質を取得した。surugamide型の基質類縁体を用いたin vitro試験の結果、全ての組換え酵素についてペプチドの環化活性が確認された。また複数の化学合成基質を用いた検討の結果、1つの環化酵素が、本来の基質とは大きく異なると考えられるb-アミノ酸やポリケタイド骨格を含む基質を効率よく環化することが判明した。以上のことから、放線菌に分布するPBP-type TEの基質選択性はいずれも寛容であること、及び選択性は酵素毎に多様性があることが実験的に示された。
放線菌の遺伝子操作により改変したNRPSとPBP-type TEを組み合わせることで、非天然型環状ペプチドの生物合成を試みた。Surugamide生合成遺伝子クラスターをモデルに複数の改変パターンでNRPSモジュールの欠損・伸長を行った。その結果、デカペプチドである環状surugamide Fを生合成するNRPSのモジュール欠損により、環サイズが縮小した非天然型の環状オクタペプチドが生産された。環状ペプチドの構造は化学合成により確認している。これにより、SurEは末端モジュールのPCPドメインだけでなく、アッセンブリーライン内部のPCPに担持されたペプチド鎖中間体に対しても作用することが明らかとなった。この性質は、SurEが様々なNRPSと相互作用しうる可能性を示唆するものであり、PBP-type TEを利用したNRPSの新しい改変手法につながると期待している。

Strategy for Future Research Activity

PBP-type TEによって生合成される新規環状ペプチドの探索を行う。具体的には、PBP-type TE遺伝子を含むクラスターの遺伝子破壊株や転写プロモーター置換株を作製し、代謝物の比較を行う。標的化合物の化学構造を決定し、それに対応する環化前駆体と環化酵素組換えタンパク質を用いて、in vitroで環化活性の検出を試みる。また、既に環化活性の検出できているホモログについては、その鎖長・アミノ酸配列を変更した基質類縁体を複数化学合成し、基質選択性の詳細を検証する。また、これらPBP-type TEの一次配列や三次元構造を比較することにより、選択性の違いを生むメカニズムを明らかにする。
NRPSの改変については、アッセンブリーラインの改変パターンをより幅広く検討し、環サイズの拡大・縮小を試みる。また、surugamide NRPSと他の環状ペプチド合成経路由来のPBP-type TEの組み合わせにより、人工環状ペプチドの合成が可能か検証する。

  • Research Products

    (9 results)

All 2020 2019

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] The Revised Structure of the Cyclic Octapeptide Surugamide A2019

    • Author(s)
      Matsuda Kenichi、Kuranaga Takefumi、Sano Ayae、Ninomiya Akihiro、Takada Kentaro、Wakimoto Toshiyuki
    • Journal Title

      Chemical and Pharmaceutical Bulletin

      Volume: 67 Pages: 476~480

    • DOI

      https://doi.org/10.1248/cpb.c19-00002

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] SurE is a trans-acting thioesterase cyclizing two distinct non-ribosomal peptides2019

    • Author(s)
      Matsuda Kenichi、Kobayashi Masakazu、Kuranaga Takefumi、Takada Kentaro、Ikeda Haruo、Matsunaga Shigeki、Wakimoto Toshiyuki
    • Journal Title

      Organic & Biomolecular Chemistry

      Volume: 17 Pages: 1058~1061

    • DOI

      10.1039/c8ob02867b

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A New Cyclase Family Catalyzing Head-to-Tail Macrolactamization of Non-ribosomal Peptides2019

    • Author(s)
      Matsuda Kenichi、Kuranaga Takefumi、Wakimoto Toshiyuki
    • Journal Title

      Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan

      Volume: 77 Pages: 1106~1115

    • DOI

      https://doi.org/10.5059/yukigoseikyokaishi.77.1106

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] バクテリアが有する新たな非リボソームペプチド環化酵素2019

    • Author(s)
      松田研一, 脇本敏幸
    • Journal Title

      バイオサイエンスとインダストリー

      Volume: 77 Pages: 306~307

  • [Journal Article] ペニシリン結合タンパク質によるペプチド環化2019

    • Author(s)
      松田 研一、倉永 健史、脇本 敏幸
    • Journal Title

      ファルマシア

      Volume: 55 Pages: 650~654

    • DOI

      https://doi.org/10.14894/faruawpsj.55.7_650

  • [Presentation] Identification and characterization of a new family of offloading cyclase in biosynthesis of non-ribosomal macrolactams.2020

    • Author(s)
      Matsuda, K., Kobayashi, M., Sano, A., Wakimoto, T.
    • Organizer
      Gordon Research Conference Marine Natural Products
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Identification of a new family of offloading cyclase in biosynthesis of non-ribosomal peptide2019

    • Author(s)
      Matsuda K.
    • Organizer
      7th Modern Solid Phase Peptide Synthesis & Its Application Symposium
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Penicillin-binding protein-type thioesterases; scope, limitation and its application2019

    • Author(s)
      Matsuda K.
    • Organizer
      13th Australian Peptide Conference
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] trans-TE NRPS の発見と機能改変2019

    • Author(s)
      松田研一
    • Organizer
      若手研究者のための有機化学札幌セミナー
    • Invited

URL: 

Published: 2021-01-27  

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