2019 Fiscal Year Research-status Report
PBP type-TEのペプチド環化触媒能の解明と環状ペプチドの多様性拡張
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19K16390
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
松田 研一 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (50812301)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 環状ペプチド / ペプチド環化酵素 / 生体触媒 / 非リボソームペプチド合成酵素 / 放線菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
官能基選択的、位置選択的なペプチド環化反応を効率よく触媒する環化酵素は、環状ペプチド効率合成にむけた生体触媒としての応用が期待できる。
我々はこれまで、放線菌の非リボソーム型環状ペプチドsurugamide類の生合成における新しいタイプのペプチド環化酵素SurEを見出し、その寛容な基質選択性を明らかにしてきた。一般的なNRPS経路の環化酵素は数MDaにおよぶ巨大酵素のC末端に融合して存在するのに対し、SurEは50 kDa程度でありNRPSから独立して存在する「単独酵素」である。SurEは一般的なNRPS環化酵素と相同性を示さない一方、ペニシリン結合タンパク質(PBP)に相同性を示すことから、我々はこれを新規ペプチド環化酵素ファミリー「PBP-type TE」として位置づけてきた。データベース検索の結果、様々な基質選択性を有するPBP-Type TEの一群が放線菌ゲノム中に見出された。そこで本研究では、これによって生合成される多様な天然環状ペプチドを同定し、各環化酵素の基質選択性の詳細な解析を行うことで、放線菌に広く分布したPBP-type TEファミリーの多様性の全容解明を目指す。本研究で得られる成果は、汎用性の高いペプチド環化触媒のライブラリー化、さらには基質選択性を拡張する触媒エンジニアリングへと展開することが期待される。また本研究では、PBP-type TEを利用したNRPSエンジニアリング手法の検討も行う。
今年度は、機能未知のPBP-type TEのクローニングを行い、それらの環化活性を評価した。これに加え、改変したNRPSとPBP-type TEを組み合わせることで、非天然型環状ペプチドの生物合成を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PBP-type TEは10%程度の放線菌が有する普遍的な生合成機構であり、これにより様々な環状ペプチドが生合成されると考えられる。個々のPBP-type TEの基質選択性を明らかにすることを目的に、PBP-type TE遺伝子を有する放線菌株を購入し、PBP-type TE遺伝子のクローニングを行った。これにより、3種類のPBP-type TEの組換えタンパク質を取得した。surugamide型の基質類縁体を用いたin vitro試験の結果、全ての組換え酵素についてペプチドの環化活性が確認された。また複数の化学合成基質を用いた検討の結果、1つの環化酵素が、本来の基質とは大きく異なると考えられるb-アミノ酸やポリケタイド骨格を含む基質を効率よく環化することが判明した。以上のことから、放線菌に分布するPBP-type TEの基質選択性はいずれも寛容であること、及び選択性は酵素毎に多様性があることが実験的に示された。
放線菌の遺伝子操作により改変したNRPSとPBP-type TEを組み合わせることで、非天然型環状ペプチドの生物合成を試みた。Surugamide生合成遺伝子クラスターをモデルに複数の改変パターンでNRPSモジュールの欠損・伸長を行った。その結果、デカペプチドである環状surugamide Fを生合成するNRPSのモジュール欠損により、環サイズが縮小した非天然型の環状オクタペプチドが生産された。環状ペプチドの構造は化学合成により確認している。これにより、SurEは末端モジュールのPCPドメインだけでなく、アッセンブリーライン内部のPCPに担持されたペプチド鎖中間体に対しても作用することが明らかとなった。この性質は、SurEが様々なNRPSと相互作用しうる可能性を示唆するものであり、PBP-type TEを利用したNRPSの新しい改変手法につながると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
PBP-type TEによって生合成される新規環状ペプチドの探索を行う。具体的には、PBP-type TE遺伝子を含むクラスターの遺伝子破壊株や転写プロモーター置換株を作製し、代謝物の比較を行う。標的化合物の化学構造を決定し、それに対応する環化前駆体と環化酵素組換えタンパク質を用いて、in vitroで環化活性の検出を試みる。また、既に環化活性の検出できているホモログについては、その鎖長・アミノ酸配列を変更した基質類縁体を複数化学合成し、基質選択性の詳細を検証する。また、これらPBP-type TEの一次配列や三次元構造を比較することにより、選択性の違いを生むメカニズムを明らかにする。
NRPSの改変については、アッセンブリーラインの改変パターンをより幅広く検討し、環サイズの拡大・縮小を試みる。また、surugamide NRPSと他の環状ペプチド合成経路由来のPBP-type TEの組み合わせにより、人工環状ペプチドの合成が可能か検証する。
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Research Products
(9 results)
