2019 Fiscal Year Research-status Report
放線菌由来ポリケタイドの多様性創出に関わる立体選択的エノイル還元機構の解明
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19K16401
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| Research Institution | Musashino University |
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Principal Investigator |
石川 和樹 武蔵野大学, 薬学部, 助教 (30779822)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Streptomyces / Acthinorhodin / エノイル還元 / Rhodococcus |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度では、エノイル還元酵素群を用いた非天然型BIQ系ポリケタイドの創製を目指し、
本酵素群による立体選択的なエノイル還元機構を解明するを目的として、下記のStep1および2について検討を行った。
【Step1：ACT生合成経路由来ActVI-2の機能解析】ActVI-2によるエノイル還元機構の解明のために、(S)-DNPAに対するエノイル還元反応を指標にActVI-2の機能解析（至適pH/補酵素など）を行った。その結果、至適pHは6.5であり、補酵素はNADPHを用いることで最も効率良く反応が進行した。また、補酵素にNADHを用いていた場合では反応は進行しなかった。また、基質特異性について検討を行った結果、立体異性体である(R)-DNPAもに対してもエノイル還元反応の進行が観察された。一方、ACT生合成中間体であるDMACでは反応が進行しなかった。これら結果から、ActVI-2は、基質の構造に対する特異性は高いが、立体化学に対する特異性は低いことが明らかになった。
【Step 2：エノイル還元酵素群の発現と精製】ACT類縁体MEDおよびGRAの生合成上に存在するエノイル還元酵素の機能解析を行うため、大腸菌を用いた組換え酵素の発現システムの構築を行った。その結果、ACT生合成酵素であるActVI-4では酵素実験に用いるのに十分な量および純度の組換え酵素が得られた。しかし、MEDおよびGRA生合成酵素であるmed9/29およびgra28/30では、発現の不調または不溶化により大腸菌を用いた酵素の取得には至らなかった。そこで、発現宿主をRhodococcus erythropolis L88株に変更し、酵素発現用ベクターの作製および発現・精製条件の検討を行った。その結果、Med9以外の酵素の取得に成功した。今後は、Med9発現条件の検討および取得できた酵素の機能解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度の目標であったStep1では、ActVI-2の機能解析を行うことでActVI-2の性状を理解することができただけでなく、エノイル還元反応における反応条件を確立することができた。また、Step2では、ActVI-2の類縁酵素と推測されていた5種類の酵素（ActVI-4、Med9/29、Gra28/30）の取得を目的に行った。その結果、酵素発現宿主を変更し、新たな発現システムを構築することでMed9以外の取得に成功した。これらの結果、今後の研究における基礎となることから本研究課題の進捗状況はおおむね順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、2019年度の研究により得られた各種酵素の機能解析を行う。Med9に関しては、微量ではあるが可溶化した酵素が確認できていることから、発現条件および精製条件の検討を行うことで精製酵素の取得を目指す。さらに、機能解析が終了したActVI-2に関しては結晶化を行いたいと考えているが、結晶化が順調に進行しない場合には分子モデリングソフトを用いたドッキングシミュレーションなどを先に行う予定である。
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| Causes of Carryover |
2019年度に酵素反応に使用する購入予定であったタイテック社製ウェルプレート・マイクロチューブ対応振とう培養器を購入せず、代わりに冷却も可能で小型のBMS社製ドライブロックインキュベーターを購入したため。これにより2020年度に繰り越させた助成金に関しては、酵素の結晶化時に用いる電動ピペッターの追加購入の一部に充てる予定である。
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Research Products
(4 results)
