2020 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of abnormal ABCG2 localization regulated by post-transcriptional modification
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19K16408
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
小森 久和 金沢大学, 薬学系, 助教 (00634180)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ABCG2 / SNP / 翻訳後修飾 / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ABCG2トランスポーターのQ141K変異体 (c.421C>A)は一遺伝子変異 (SNP) により141番目のglutamine残基 (Gln) からlysine残基 (Lys) に置換している。Lysはユビキチン化やアセチル化を受けるアミノ酸残基であることから、翻訳後修飾の変化に基づいてQ141K変異体の異常発現メカニズムを明らかにすることを目的としてきた。前年度までの検討により、野生型における141番目のGln (Gln141) はタンパク質安定化に寄与する可能性、またLys (Lys141) での翻訳後修飾がオルガネラからの脱出に寄与する可能性が得られていた。そこで、本年度はこれらをさらにサポートする結果を得るため、どの翻訳後修飾が何に寄与するかを主に検討した。
タンパク質安定性を追跡したところ、Q141K変異体のLys141での修飾がタンパク質分解を促進すること、加えてQ141K同様に形質膜発現が低いQ141Rが分解されずにいずれかのオルガネラにトラップされていることが示唆された。さらにオルガネラマーカーとの共局在を検討したところ、Q141Rでは初期エンドソームマーカーとの共局在が高く、また、Q141Kはユビキチン化阻害剤処置下で初期エンドソームマーカーとの共局在が増加傾向であったことからLys141での翻訳後修飾は初期から後期エンドソームに移行する過程に寄与することが示唆された。また、この結果はユビキチン化阻害剤によりQ141Kの発現量を増加できる可能性を示す結果である。さらに、Lys141でのユビキチン化を実際に検出するための検討に取り組んでおり、今年度はLC-MS/MSを用いることで、アミノ酸残基特異的な翻訳後修飾と発現・局在の関係を明らかにするほか、翻訳後修飾を調節する薬物を用いてQ141K変異体の発現を回復させる方法を探索する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの検討により、Q141K変異体のlysosome分解の亢進が示されていたことから、安定性の評価を行った。本検討でもLys141で修飾を受けないモデルとしてLysからArgに置換したQ141R変異体を用いた。タンパク質翻訳阻害剤cycloheximide処置下、Q141K変異体は経時的に減少し、タンパク質安定性が低下していることが改めて示された。一方Q141R変異体は野生型と比較して総タンパク質はほとんど減少しなかった。すなわち、先の検討で得られたQ141R変異体が何かしらのオルガネラでトラップされている可能性を裏付ける結果が得られた。
そこで、蛍光標識したオルガネラマーカータンパク質を発現させ、ABCG2との共局在を評価した。Q141K変異体は初期エンドソームRab5と後期エンドソームマーカーRab7との共局在は同程度だった。一方、Q141R変異体はRab5との共局在が高い傾向が見られ、Q141RはRab5でトラップされている可能性が考えられた。また、ユビキチン化阻害剤処置下でQ141K変異体はRab7よりもRab5との共局在が高い傾向であった。すなわち、Q141K変異体のLys141でのユビキチン化は初期エンドソームから後期エンドソームへの移行に寄与していることが示唆された。
さらに、実際に、Q141K変異体のLys141でユビキチン修飾されるかLC-MS/MSを用いて検出を試みた。しかしながら、Lys141を含む領域のペプチド断片検出が難しく、サンプル調製や検出方法を模索している段階である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 部位特異的な翻訳後修飾の同定
昨年度に引き続き、LC-MS/MSによる翻訳後修飾部位の同定部位を広げる。サンプル調製や測定方法等を工夫することでペプチド検出カバー率を向上させる。また、翻訳後修飾間のクロストークが報告されていることから、Lys残基のユビキチン化やアセチル化だけでなく、リン酸化等の他のアミノ酸の修飾も同時に同定することで、ユビキチン化の調節に寄与する翻訳後修飾を探索する。
2. Q141K変異体の発現増加に寄与する薬物の探索
これまでの検討の中で、ユビキチン化酵素あるいは脱アセチル化酵素のサブクラスを広く阻害する阻害剤を用いてQ141K変異体の発現が増大することが示唆された。さらに今年度はQ141K変異体の発現増加に特異的に寄与するサブクラスを同定する。また、阻害剤処置により変化する翻訳後修飾部位をアミノ酸残基特異的に検出し、Lys141だけでなくも他のアミノ酸残基も含めて発現増加に寄与した翻訳後修飾を見出す。
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| Causes of Carryover |
学術集会に参加して成果を報告する予定であったが、中止あるいは延期のため令和2年度は学会発表を見送った。そのため、当初予定していた旅費分に残額が生じた。一方で、測定委託で難航したため、予定よりもサンプル調製のための試薬購入で物品費が増加した。
これらの結果、今回の残額が生じる結果となったが、引き続き測定委託のためのサンプル調製費用として次年度に使用予定である。
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